引用本文： 姜大庆, 谷天祥, 徐兆发, 张光伟, 毛乃惠. 心肌细胞外基质对心肌球源性心肌干细胞体外分化、增殖及凋亡影响的研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2016, 23(9): 901-906. doi: 10.7507/1007-4848.20160216 复制
2004年，Messina等[1]报道一种从鼠科动物以及人类心房、心室心肌组织内分离表达c-kit心肌干细胞的新方法[2-3]。3年后，Smith等[4]应用人类和猪的心肌球（CS）获得了心肌球源性干细胞（CDCs）并证实CDCs能够改善心肌梗死后心脏功能并促进梗死组织心肌及血管再生。
近来体外研究证实组织特异性的心肌组织源性细胞外基质（ECM）能显著改善皮肤、肌肉及肝脏细胞的粘附，生长速度及相关表型表达。ECM中玻连蛋白能够促进干细胞的自我更新和增殖，而纤维连接蛋白（FN）、Ⅳ型胶原、层粘连蛋白可促进干细胞向不同的细胞分化[5-6]。近来有研究表明向心肌梗死后瘢痕组织内注入心肌源性的ECM能够显著增加梗死区域的厚度，缓解梗死扩张及左室的矛盾收缩膨出，提高左心室射血分数（LVEF）[7]。我们由此推测CDCs在心肌组织源性的ECM上会生长得更好，且具有较高的向心肌细胞及血管细胞分化的潜能。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要试剂与仪器
主要试剂包括IMDM培养液、胎牛血清、L-谷氨酸、2-巯基乙醇、胰蛋白酶、不含钙镁的磷酸盐缓冲液（PBS）、FN、多聚-D-赖氨酸（PDL）、10×MEM，兔抗平滑肌细胞（α-SMA）多克隆抗体，兔抗vWF多克隆抗体，小鼠抗α-SA单克隆抗体（Abcam公司）；兔抗c-kit多克隆抗体，FITC-标记二抗，PE-标记二抗（SantaCruz公司）。主要仪器包括凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，Ⅰ型鼠尾胶原胶（3.75 mg/ml）（碧云天）；T10 basic ULTRA-TURRAX匀浆机（IKA，Wilmington，North Carolina）和FACSCAN流式细胞仪（美国Becton Dickison公司）。
1.2 方法
1.2.1 大鼠CDC分离及培养
采用成年Wistar雄性大鼠，体重（170±10）g。参照Messina等的CDC培养法培养[1]。无菌条件下取Wistar大鼠心脏，PBS彻底清洗，将心肌组织剪碎成大约1 mm×1 mm×1 mm的组织块，采用组织块酶消化法以CEM培养液（IMDM、 20% FBS、 1 U/ml青链霉素，0.2 mM L-谷氨酸，0.1 mM2-巯基乙醇）培养组织块源性细胞（EDC）。1～2周后当EDCs生长至70%~80%融合时，采集EDCs。将EDC以50 000～100 000/孔的密度移入12孔培养板中加入CGM培养液（35% IMDM/65% DMEM/F-12混合液、3.5% FBS、 1%青霉素-链霉素、1%L-谷氨酸、0.1 mM 2-巯基乙醇、1单位/ml凝血酶、2% B-27溶液、80 ng/ml bFGF、
25 ng/ml EGF以及4 ng/ml心肌营养素-1）培养心肌球（CS）。6～7 d后心肌球生成，采集心肌球重新平铺于FN包被的（TCP组）或ECM包被的（ECM组）培养皿中继续培养获得CDC。ECM组常规包被FN后，再过夜包被ECM悬液（1 mg/ml）。每2～3 d更换一次培养液。心肌球平铺6～7 d后，采集并鉴定CDCs（3代内的CDCs）。
1.2.2 大鼠心肌源性脱细胞ECM的制备
按照Dai等[7]的方案制备大鼠心肌源性ECM。具体方案如下：取雌性Wistar大鼠心脏，组织粉碎机（IKA，Wilmington，North Carolina）将心肌组织做成匀浆悬液，离心去上清。应用DNAse和RNAse去除核酸物质。通过反复离心洗涤最终将得到的ECM置于-80 ℃保存备用。体重200 g左右的大鼠心脏可制备10 mg的ECM。
Ⅰ型鼠尾胶原胶（3.75 mg/ml）3 ml+10×MEM 1 ml+ nuclease free无菌水6 ml，配置成10 ml浓度为1 mg/ml的Ⅰ型鼠尾胶原胶溶液，制备成1 mg/ml的ECM溶液，可用于包被培养皿。用HE染色检测ECM中是否有细胞成分残余。
1.2.3 免疫荧光检测CDC中c-kit表达
胰酶消化采集第2代CDC至24孔培养板，10 000/well，贴壁12 h。应用免疫荧光法鉴定CDC体外培养表达c-kit情况。兔抗大鼠c-kit多克隆抗体，FITC-标记二抗，DAPI染核，荧光显微镜下观察。
1.2.4 CDC体外包被培养皿的增殖分化及凋亡对比（ECM vs FN）
用ECM悬液（ECM组）或FN包被（FN组）适当数目的96孔培养板，用胰酶消化法采集第2代CDC至96孔培养板，5 000/well，同一般培养条件，培养12 h，1 d，3 d，7 d以及14 d。应用MTT法对比两组CDC体外增殖情况。使用免疫荧光法鉴定两组CDC表达vWF、α-SA及α-SMA表达率。一抗：兔抗大鼠-vWF，兔抗大鼠-α-SMA，小鼠抗大鼠-心肌细胞；二抗PE标记，荧光显微镜下观察。按照凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒操作说明进行，对比两组凋亡率（图 1）。
图1
实验流程图
1.3 统计学分析
实验所得数据以均值±标准差（
2 结果
2.1 大鼠CDC体外培养形态及c-kit表达鉴定
心肌组织块平铺于FN包被的培养皿上3～5 d后，从心肌组织块中生长出EDC（图 2A、2B、2C）。EDC平铺于PDL包被的12孔培养板后5～7 d可生长出一代心肌球（图 2D、2E），采集一代心肌球平铺于FN包被的60 mm培养皿后3～5 d生长出CDC（图 2F、图 2G）。体外免疫荧光检测提示心肌球中心部为大量表达c-kit的细胞，心肌球平铺后的CDC也表达c-kit（图 2H、2I）。
图2
大鼠CDC体外培养形态及c-kit表达鉴定
注：A、B、C为小圆亮细胞从成纤维细胞样细胞床上爬出（EDC）；D、E：CDC平铺于PDL包被的12孔培养板后2～3 d后可形成一代心肌球；F：第7 d后采集心肌球培养CDC；G：CDCs从平铺第3 d的心肌球内爬出；H：心肌球平铺5～6 d后的CDCs生长状态，传代第2代；I：用于在体移植前的CDCs在心肌球平铺第3 d（A）后及第6 d（B）后表达c-kit
2.2 大鼠心肌ECM制备后HE染色
本实验中所应用心肌源性ECM的制备方法可彻底清除细胞成分，并完整保留了ECM的成分及结构（图 3）。
图3
大鼠心肌ECM内无细胞成分残留，且完整保留了ECM结构
注：A为正常大鼠心脏组织结构（对照）；B为脱细胞化大鼠心肌ECM
2.3 大鼠CDC体外分化、增殖、凋亡对比（ECM vs TCP）
体外荧光鉴定提示ECM包被的培养皿内生长的CDC v-WF，α-SA、α-SMA表达率较常规FN包被的培养皿内生长的CDC的表达率显著增高（分别为0.060±0.002 vs. 0.043±0.002，P < 0.001；0.082±0.003 vs. 0.051±0.002，P < 0.001；0.055±0.002 vs. 0.034±0.001，P < 0.001）（图 4 A、4B、4C），且ECM包被的培养皿内生长的CDC具有较高的增殖活力以及较低的凋亡率（0.052±0.002 vs. 0.025±0.001，P < 0.001）（图 4），差异有统计学意义。
图4
培养在ECM或常规FN包被的（TCP）培养皿上的CDCs14 d后表达vWF、 α-SA以及α-SMA（A、B、C）
注：D为培养在ECM或常规FN包被的（TCP）培养皿上的CDCs在不同时点（12 h、1 d、3 d、7 d、14 d）的增殖对比，*
3 讨论
2004年，Messina等[1]报道了一种从鼠科动物以及人类心房、心室心肌组织内分离心肌干细胞的新方法。首次报告3年后，Smith等[4]应用人类和猪的心肌球（CS）获得了心肌球源性干细胞（CDCs）并发现CDC为c-kit+。
到目前为止，许多可注入型生物材料，如玻尿酸[8]、纤维蛋白胶[9]、胶原[10]、藻酸盐[11]、小肠ECM [12]、心包ECM [13]、自组装肽物质[14]、血小板胶[15]、心室肌ECM [16]，在不同的心肌梗死动物模型中评估了其治疗价值，取得了与单独干细胞移植相似的治疗效果。可注入型生物材料能促进位于生物材料微环境中的干细胞向内皮细胞及血管平滑肌及α-SA分化[10, 17-21]。
同组织来源的细胞在其相对应组织来源的ECM上生长最好，即肝脏细胞在肝脏源性的ECM上生长最佳，皮肤细胞在皮肤源性的ECM上生长最佳，肌细胞在肌源性的ECM上生长最佳[22-25]，同理我们推测心肌源性CDC在心肌源性的ECM上生长最好，可能成为修补受损心肌的一个最有应用前景的生物材料。
与以往研究结果类似，本实验细胞培养法也获得表达c-kit的CDC细胞（图 2），脱细胞法所获得的心肌源性ECM较好地保留了心肌细胞外ECM的结构及成分（图 3），提示其可为CDC提供更加良好的生长微环境。本次研究也证实了心肌源性ECM能够促进体外CDC增殖，抑制CDC凋亡及坏死（图 4），并促进CDC表达α-SA、α-SMA及vWF（图 4）。依据上述实验结果，我们有理由将CDC进一步应用于在体研究评价在体携带CDC的治疗价值，并可以将前述研究的生物材料与心肌源性的ECM体外及体内对CDC分化增殖凋亡影响做对比研究，推测研究结果应提示心肌源性的ECM具有较其他生物材料为优的治疗价值。以上结果提示本实验提取的心肌组织源性ECM可考虑应用于在体携带干细胞治疗缺血性心肌病或心肌梗死，从而为将来临床应用心肌组织源性ECM携带心肌干细胞治疗缺血性心肌病或心肌梗死提供了一定的理论依据。
2004年，Messina等[1]报道一种从鼠科动物以及人类心房、心室心肌组织内分离表达c-kit心肌干细胞的新方法[2-3]。3年后，Smith等[4]应用人类和猪的心肌球（CS）获得了心肌球源性干细胞（CDCs）并证实CDCs能够改善心肌梗死后心脏功能并促进梗死组织心肌及血管再生。
近来体外研究证实组织特异性的心肌组织源性细胞外基质（ECM）能显著改善皮肤、肌肉及肝脏细胞的粘附，生长速度及相关表型表达。ECM中玻连蛋白能够促进干细胞的自我更新和增殖，而纤维连接蛋白（FN）、Ⅳ型胶原、层粘连蛋白可促进干细胞向不同的细胞分化[5-6]。近来有研究表明向心肌梗死后瘢痕组织内注入心肌源性的ECM能够显著增加梗死区域的厚度，缓解梗死扩张及左室的矛盾收缩膨出，提高左心室射血分数（LVEF）[7]。我们由此推测CDCs在心肌组织源性的ECM上会生长得更好，且具有较高的向心肌细胞及血管细胞分化的潜能。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要试剂与仪器
主要试剂包括IMDM培养液、胎牛血清、L-谷氨酸、2-巯基乙醇、胰蛋白酶、不含钙镁的磷酸盐缓冲液（PBS）、FN、多聚-D-赖氨酸（PDL）、10×MEM，兔抗平滑肌细胞（α-SMA）多克隆抗体，兔抗vWF多克隆抗体，小鼠抗α-SA单克隆抗体（Abcam公司）；兔抗c-kit多克隆抗体，FITC-标记二抗，PE-标记二抗（SantaCruz公司）。主要仪器包括凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，Ⅰ型鼠尾胶原胶（3.75 mg/ml）（碧云天）；T10 basic ULTRA-TURRAX匀浆机（IKA，Wilmington，North Carolina）和FACSCAN流式细胞仪（美国Becton Dickison公司）。
1.2 方法
1.2.1 大鼠CDC分离及培养
采用成年Wistar雄性大鼠，体重（170±10）g。参照Messina等的CDC培养法培养[1]。无菌条件下取Wistar大鼠心脏，PBS彻底清洗，将心肌组织剪碎成大约1 mm×1 mm×1 mm的组织块，采用组织块酶消化法以CEM培养液（IMDM、 20% FBS、 1 U/ml青链霉素，0.2 mM L-谷氨酸，0.1 mM2-巯基乙醇）培养组织块源性细胞（EDC）。1～2周后当EDCs生长至70%~80%融合时，采集EDCs。将EDC以50 000～100 000/孔的密度移入12孔培养板中加入CGM培养液（35% IMDM/65% DMEM/F-12混合液、3.5% FBS、 1%青霉素-链霉素、1%L-谷氨酸、0.1 mM 2-巯基乙醇、1单位/ml凝血酶、2% B-27溶液、80 ng/ml bFGF、
25 ng/ml EGF以及4 ng/ml心肌营养素-1）培养心肌球（CS）。6～7 d后心肌球生成，采集心肌球重新平铺于FN包被的（TCP组）或ECM包被的（ECM组）培养皿中继续培养获得CDC。ECM组常规包被FN后，再过夜包被ECM悬液（1 mg/ml）。每2～3 d更换一次培养液。心肌球平铺6～7 d后，采集并鉴定CDCs（3代内的CDCs）。
1.2.2 大鼠心肌源性脱细胞ECM的制备
按照Dai等[7]的方案制备大鼠心肌源性ECM。具体方案如下：取雌性Wistar大鼠心脏，组织粉碎机（IKA，Wilmington，North Carolina）将心肌组织做成匀浆悬液，离心去上清。应用DNAse和RNAse去除核酸物质。通过反复离心洗涤最终将得到的ECM置于-80 ℃保存备用。体重200 g左右的大鼠心脏可制备10 mg的ECM。
Ⅰ型鼠尾胶原胶（3.75 mg/ml）3 ml+10×MEM 1 ml+ nuclease free无菌水6 ml，配置成10 ml浓度为1 mg/ml的Ⅰ型鼠尾胶原胶溶液，制备成1 mg/ml的ECM溶液，可用于包被培养皿。用HE染色检测ECM中是否有细胞成分残余。
1.2.3 免疫荧光检测CDC中c-kit表达
胰酶消化采集第2代CDC至24孔培养板，10 000/well，贴壁12 h。应用免疫荧光法鉴定CDC体外培养表达c-kit情况。兔抗大鼠c-kit多克隆抗体，FITC-标记二抗，DAPI染核，荧光显微镜下观察。
1.2.4 CDC体外包被培养皿的增殖分化及凋亡对比（ECM vs FN）
用ECM悬液（ECM组）或FN包被（FN组）适当数目的96孔培养板，用胰酶消化法采集第2代CDC至96孔培养板，5 000/well，同一般培养条件，培养12 h，1 d，3 d，7 d以及14 d。应用MTT法对比两组CDC体外增殖情况。使用免疫荧光法鉴定两组CDC表达vWF、α-SA及α-SMA表达率。一抗：兔抗大鼠-vWF，兔抗大鼠-α-SMA，小鼠抗大鼠-心肌细胞；二抗PE标记，荧光显微镜下观察。按照凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒操作说明进行，对比两组凋亡率（图 1）。
图1
实验流程图
1.3 统计学分析
实验所得数据以均值±标准差（
2 结果
2.1 大鼠CDC体外培养形态及c-kit表达鉴定
心肌组织块平铺于FN包被的培养皿上3～5 d后，从心肌组织块中生长出EDC（图 2A、2B、2C）。EDC平铺于PDL包被的12孔培养板后5～7 d可生长出一代心肌球（图 2D、2E），采集一代心肌球平铺于FN包被的60 mm培养皿后3～5 d生长出CDC（图 2F、图 2G）。体外免疫荧光检测提示心肌球中心部为大量表达c-kit的细胞，心肌球平铺后的CDC也表达c-kit（图 2H、2I）。
图2
大鼠CDC体外培养形态及c-kit表达鉴定
注：A、B、C为小圆亮细胞从成纤维细胞样细胞床上爬出（EDC）；D、E：CDC平铺于PDL包被的12孔培养板后2～3 d后可形成一代心肌球；F：第7 d后采集心肌球培养CDC；G：CDCs从平铺第3 d的心肌球内爬出；H：心肌球平铺5～6 d后的CDCs生长状态，传代第2代；I：用于在体移植前的CDCs在心肌球平铺第3 d（A）后及第6 d（B）后表达c-kit
2.2 大鼠心肌ECM制备后HE染色
本实验中所应用心肌源性ECM的制备方法可彻底清除细胞成分，并完整保留了ECM的成分及结构（图 3）。
图3
大鼠心肌ECM内无细胞成分残留，且完整保留了ECM结构
注：A为正常大鼠心脏组织结构（对照）；B为脱细胞化大鼠心肌ECM
2.3 大鼠CDC体外分化、增殖、凋亡对比（ECM vs TCP）
体外荧光鉴定提示ECM包被的培养皿内生长的CDC v-WF，α-SA、α-SMA表达率较常规FN包被的培养皿内生长的CDC的表达率显著增高（分别为0.060±0.002 vs. 0.043±0.002，P < 0.001；0.082±0.003 vs. 0.051±0.002，P < 0.001；0.055±0.002 vs. 0.034±0.001，P < 0.001）（图 4 A、4B、4C），且ECM包被的培养皿内生长的CDC具有较高的增殖活力以及较低的凋亡率（0.052±0.002 vs. 0.025±0.001，P < 0.001）（图 4），差异有统计学意义。
图4
培养在ECM或常规FN包被的（TCP）培养皿上的CDCs14 d后表达vWF、 α-SA以及α-SMA（A、B、C）
注：D为培养在ECM或常规FN包被的（TCP）培养皿上的CDCs在不同时点（12 h、1 d、3 d、7 d、14 d）的增殖对比，*
3 讨论
2004年，Messina等[1]报道了一种从鼠科动物以及人类心房、心室心肌组织内分离心肌干细胞的新方法。首次报告3年后，Smith等[4]应用人类和猪的心肌球（CS）获得了心肌球源性干细胞（CDCs）并发现CDC为c-kit+。
到目前为止，许多可注入型生物材料，如玻尿酸[8]、纤维蛋白胶[9]、胶原[10]、藻酸盐[11]、小肠ECM [12]、心包ECM [13]、自组装肽物质[14]、血小板胶[15]、心室肌ECM [16]，在不同的心肌梗死动物模型中评估了其治疗价值，取得了与单独干细胞移植相似的治疗效果。可注入型生物材料能促进位于生物材料微环境中的干细胞向内皮细胞及血管平滑肌及α-SA分化[10, 17-21]。
同组织来源的细胞在其相对应组织来源的ECM上生长最好，即肝脏细胞在肝脏源性的ECM上生长最佳，皮肤细胞在皮肤源性的ECM上生长最佳，肌细胞在肌源性的ECM上生长最佳[22-25]，同理我们推测心肌源性CDC在心肌源性的ECM上生长最好，可能成为修补受损心肌的一个最有应用前景的生物材料。
与以往研究结果类似，本实验细胞培养法也获得表达c-kit的CDC细胞（图 2），脱细胞法所获得的心肌源性ECM较好地保留了心肌细胞外ECM的结构及成分（图 3），提示其可为CDC提供更加良好的生长微环境。本次研究也证实了心肌源性ECM能够促进体外CDC增殖，抑制CDC凋亡及坏死（图 4），并促进CDC表达α-SA、α-SMA及vWF（图 4）。依据上述实验结果，我们有理由将CDC进一步应用于在体研究评价在体携带CDC的治疗价值，并可以将前述研究的生物材料与心肌源性的ECM体外及体内对CDC分化增殖凋亡影响做对比研究，推测研究结果应提示心肌源性的ECM具有较其他生物材料为优的治疗价值。以上结果提示本实验提取的心肌组织源性ECM可考虑应用于在体携带干细胞治疗缺血性心肌病或心肌梗死，从而为将来临床应用心肌组织源性ECM携带心肌干细胞治疗缺血性心肌病或心肌梗死提供了一定的理论依据。
