引用本文： 黄功成, 舒礼良, 黄辰, 朱效华, 魏廷举, 徐敬. 探讨CYP2C9及VKORC高活性对华法林抗凝的影响及对策. 中国胸心血管外科临床杂志, 2014, 21(5): 609-613. doi: 10.7507/1007-4848.20140174 复制
心脏机械瓣置换术后需要终身接受抗凝治疗，华法林（warfarin）是临床上应用最广泛的口服抗凝药，主要用于预防及治疗深静脉血栓、肺栓塞、脑梗塞、心房颤动及并发血栓形成、心脏瓣膜置换术后及其他血栓性疾病[1-4]。然而，华法林治疗窗窄、个体差异大，且易受其他因素影响（药物、饮食等）[4-8]。剂量过小不能达到满意的抗凝效果，剂量过大可能会导致致命性出血。而细胞色素P450 2C9酶（CYP2C9）及维生素K环氧化物还原酶（VKORC）的基因多态性会影响华法林的用药剂量，在应用华法林前，检测患者的基因多态性对于其在临床安全有效地应用十分必要。我们对40例CYP2C9及VKORC高活性心瓣膜置换术患者术后抗凝及并发症发生进行了分析。
1 资料与方法
1.1 临床资料和分组
2010年2月至2013年5月期间行心瓣膜置换术患者40例，其中男18例、女22例，年龄40～51（45.18±2.93）岁。行二尖瓣置换术（MVR）18例，二尖瓣置换+三尖瓣成形术（TVP）14例，双瓣膜置换术（DVR）8例。所有患者均无心房颤动病史，均使用同一厂家生产的机械瓣。根据术前是否行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测，分为两组，A组：20例，术前未行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测；B组：20例，术前已行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测，19例为CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）阳性，VKORC1-1639 GA阳性；1例为CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）阳性，VKORC1-1639 GG阳性；两组患者的临床资料见表 1。
表1
两组患者的临床资料［（1.2 方法
1.2.1 用药方法
A组：术前未行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测，术后第2 d给予常规推荐剂量华法林2.5 mg/d，后根据国际标准化比值（INR）值调整华法林用量，统计达到预期值时的用药时间及并发症发生情况，于术后3个月查CYP2C9和VKORC1基因多态性。B组：术前已行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测，CYP2C9和VKORC1基因均为高活性，根据公式[参考药理学公式（www.warfarindosing.org），包括VKORC1和CYP2C9基因型、年龄、性别、体重、身高、目标INR值、胺碘酮使用情况、吸烟史及华法林应用指征等因素]计算出华法林推荐剂量，同时给予阿司匹林100 mg/d及低分子肝素0.4 ml/d，后根据INR值调整华法林用量，待INR达到预期值后停用阿司匹林及低分子肝素，统计达到预期值时的用药时间及并发症发生情况。
1.2.2 基因的检测方法
采用聚合酶链反应（PCR）-芯片杂交法检测基因，试剂盒（上海百傲科技有限公司，产品编号：YZB/国4789-2012）采用从人外周血细胞中提取的基因组脱氧核糖核酸（DNA），用CYP2C9、VKORC1基因特异引物经PCR扩增后，将带生物素标记的扩增产物与固定在醛基基片上的CYP2C9、VKORC1基因型检测探针进行特异杂交反应，并通过酶促显色反应，使特异性杂交信号呈现出颜色，通过对芯片进行扫描，得到样品DNA扩增产物与每个基因位点的野生型和突变型探针杂交形成的杂交图像；经软件分析该图像，判断待检样品的基因型。
根据基因型检测结果确定华法林起始剂量时，可参考美国食品药品监督管理局（FDA）认可的不同基因型华法林起始剂量（mg/d）[9]；见表 2。
表2
不同基因型华法林起始剂量（mg/d）
1.3 随访
术后随访3～12个月，出院后，每月1次电话随访，记录每次复查INR值、并发症发生及恢复情况，并根据INR值及临床症状、治疗情况给出建议华法林用量及复查时机。
1.4 统计学分析
所有数据均用SPSS 21.0统计软件进行统计处理，计量资料采用均数±标准差（
2 结果
A组患者术后常规给予华法林2.5 mg/d，根据INR值调整华法林用量，其中2例于术后第8 d、第12 d出现不同程度的言语不清，行头颅CT示：脑梗死，经积极治疗后，随访6个月，1例症状明显好转，1例仍表现为右侧肢体共济失调；2例术后第9 d、第16 d出现下肢疼痛，彩色超声波示：腘动脉血栓；1例术后第22 d发生肺栓塞；1例术后第12 d复查彩色超声心动图示：人工瓣膜瓣环血栓形成；14例分别于第15～20 d达到预期INR值，无明显血栓并发症。术后3个月行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测，其中17例为CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）阳性，VKORC1-1639 GA阳性；3例为CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）阳性，VKORC1-1639 GG阳性。B组患者术后第2 d给予华法林推荐量的同时给予阿司匹林（100 mg/d）及低分子肝素（0.4 ml/d），分别于第5～9 d达到华法林预期值，后停用阿司匹林及低分子肝素；随访6个月无明显血栓并发症，仅1例出现鼻腔出血并发症，经鼻孔填塞后好转。两组患者的随访结果见表 3。
表3
两组患者的随访结果［例（%）/（3 讨论
人工机械瓣膜置换术后患者均需终身服用抗凝药，目前国内一般用口服华法林抗凝治疗[10]。但与抗凝治疗有关的出血及血栓形成是心瓣膜置换术后常见且可危及生命的并发症[11]，如卡瓣，肢体栓塞、脑梗死，甚至发生猝死[10, 12]，华法林过量又易导致出血[10, 13]。而将不同患者的华法林剂量调整到既安全又有效的范围，是长期以来临床用药上一个非常棘手的问题。
华法林是由S-对映体和R-对映体组成的消旋化合物，其中，S-华法林抗凝活性是R-华法林抗凝活性的3～5倍，提供了华法林70％的抗凝活性[14-15]。两种对映体在体内被不同的细胞色素P450（cytoch-rome P450，CYP）同工酶通过羧基化代谢成非活性产物。S-华法林85％以上由CYP2C9代谢为无活性的6-羟化产物和7-羟化产物；而R-华法林主要经CYP3A4、1A1、lA2代谢[16]，对华法林剂量影响最大的是CYP2C9。
华法林通过抑制VKORC，阻止了维生素K的循环应用，使凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ以及蛋白C和S无法羧化而停留在没有抗凝活性的前体阶段，从而达到抗凝的目的。VKORC是维生素K依赖性凝血因子生成的限速酶。因此，临床上主要应用对CYP2C9及VKORC的检测来评估华法林用量。CYP2C9与VKORCl基因型分布有明显的种族差异。Yang等[17]进行的分析显示，亚洲人群中VKORCl-1639AA、AG及GG基因型频率分别为0.804，0.183和0.013，而高加索人群分别为0.163，0.489和0.367。这也是我国与西方国家华法林用量的差异所在。虽然CYP2C9及VKORC高活性在我国只占极少，但对于心瓣膜置换术后给予华法林用量却至关重要。
2008年，美国胸科医师协会（ACCP）指南[18-19]中推荐心脏机械瓣膜置换术后INR的控制范围为2.0～3.5，其中主动脉瓣置换术后INR为2.0～3.0，二尖瓣置换术后INR为2.5～3.5。目前一些国外研究建议INR控制范围低于指南推荐的范围[19-24]。关于中国人机械瓣膜置换术后患者合适的INR控制范围一直存在争议，一般认为中国人心瓣膜置换术后INR控制在1.6～2.6是合理的[25-27]。我们设置的预期INR值为1.5～2.5。而不同瓣位的心脏机械瓣置换术后患者的相对安全INR范围不同。
本组CYP2C9和VKORC1高活性患者心瓣膜置换术后的抗凝情况，其中术前行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测患者，根据上述公式计算出华法林推荐量，后根据INR值调整用量，术后血栓并发症发生率与未行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测者给予常规推荐华法林剂量相比差异有统计学意义。术前未行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测，术后1个月内有6例出现抗凝并发症，发生率高达30%，明显高于文献报道。我们认为其原因：（1）此研究主要讨论CYP2C9及VKORC高活性患者，患者本身就对华法林抗凝不敏感，与敏感者相比易发生血栓栓塞；（2）VKORC高活性患者VKORCl-1639AG及GG基因型频率为0.183和0.013，远低于VKORCl-1639AA基因型频率的0.804，属于少数人群；（3）本组并发症的发生率只代表CYP2C9和VKORC高活性患者（只占人群极少部分），因此与人群相比要高。因此，我们认为术前行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测有其必要性，对于我国大多数人其表现为CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）阳性，VKORC1-1639 AA阳性，达到治疗窗时间短，术后栓塞并发症的发生相对较少，而对那些CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）阳性，VKORC1-1639 GA/GG阳性者则需要的华法林剂量大、时间长，才能达到预期INR值，这个过程中极易发生血栓形成并发症，应提高警惕。根据我们的经验，对于CYP2C9及VKORC高活性患者术后给予华法林的同时加阿司匹林（100 mg/d）及低分子肝素（0.4 ml/d），待INR达到预期值后停用阿司匹林及低分子肝素，有其必要性。可以减少心瓣膜置换术后栓塞的发生及达到华法林治疗窗的时间。根据临床经验行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测，所计算出来的华法林推荐量部分与临床实际观察不符，实际应用华法林量不能完全依赖计算结果，因为华法林同样受饮食、药物等其他因素的影响。还要根据检测的INR值来调整用量，但是检测结果为CYP2C9及VKORC高活性者，预示着华法林用量大，达标值（INR）用时长，有很高的预测性，可以提示我们在加强抗凝的同时应用阿司匹林和肝素。有研究认为，术后早期以肝素作为华法林起效之前的抗凝治疗，进行华法林和肝素联合使用，安全性较单纯口服华法林高 [28-29]。与我们的研究结果相一致。
因此，术前检测VKORCl和CYP2C9基因多态性可以预测华法林用量，并根据结果调整抗凝方案，有助于减少心瓣膜置换术后抗凝治疗所引起的栓塞并发症。
心脏机械瓣置换术后需要终身接受抗凝治疗，华法林（warfarin）是临床上应用最广泛的口服抗凝药，主要用于预防及治疗深静脉血栓、肺栓塞、脑梗塞、心房颤动及并发血栓形成、心脏瓣膜置换术后及其他血栓性疾病[1-4]。然而，华法林治疗窗窄、个体差异大，且易受其他因素影响（药物、饮食等）[4-8]。剂量过小不能达到满意的抗凝效果，剂量过大可能会导致致命性出血。而细胞色素P450 2C9酶（CYP2C9）及维生素K环氧化物还原酶（VKORC）的基因多态性会影响华法林的用药剂量，在应用华法林前，检测患者的基因多态性对于其在临床安全有效地应用十分必要。我们对40例CYP2C9及VKORC高活性心瓣膜置换术患者术后抗凝及并发症发生进行了分析。
1 资料与方法
1.1 临床资料和分组
2010年2月至2013年5月期间行心瓣膜置换术患者40例，其中男18例、女22例，年龄40～51（45.18±2.93）岁。行二尖瓣置换术（MVR）18例，二尖瓣置换+三尖瓣成形术（TVP）14例，双瓣膜置换术（DVR）8例。所有患者均无心房颤动病史，均使用同一厂家生产的机械瓣。根据术前是否行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测，分为两组，A组：20例，术前未行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测；B组：20例，术前已行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测，19例为CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）阳性，VKORC1-1639 GA阳性；1例为CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）阳性，VKORC1-1639 GG阳性；两组患者的临床资料见表 1。
表1
两组患者的临床资料［（1.2 方法
1.2.1 用药方法
A组：术前未行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测，术后第2 d给予常规推荐剂量华法林2.5 mg/d，后根据国际标准化比值（INR）值调整华法林用量，统计达到预期值时的用药时间及并发症发生情况，于术后3个月查CYP2C9和VKORC1基因多态性。B组：术前已行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测，CYP2C9和VKORC1基因均为高活性，根据公式[参考药理学公式（www.warfarindosing.org），包括VKORC1和CYP2C9基因型、年龄、性别、体重、身高、目标INR值、胺碘酮使用情况、吸烟史及华法林应用指征等因素]计算出华法林推荐剂量，同时给予阿司匹林100 mg/d及低分子肝素0.4 ml/d，后根据INR值调整华法林用量，待INR达到预期值后停用阿司匹林及低分子肝素，统计达到预期值时的用药时间及并发症发生情况。
1.2.2 基因的检测方法
采用聚合酶链反应（PCR）-芯片杂交法检测基因，试剂盒（上海百傲科技有限公司，产品编号：YZB/国4789-2012）采用从人外周血细胞中提取的基因组脱氧核糖核酸（DNA），用CYP2C9、VKORC1基因特异引物经PCR扩增后，将带生物素标记的扩增产物与固定在醛基基片上的CYP2C9、VKORC1基因型检测探针进行特异杂交反应，并通过酶促显色反应，使特异性杂交信号呈现出颜色，通过对芯片进行扫描，得到样品DNA扩增产物与每个基因位点的野生型和突变型探针杂交形成的杂交图像；经软件分析该图像，判断待检样品的基因型。
根据基因型检测结果确定华法林起始剂量时，可参考美国食品药品监督管理局（FDA）认可的不同基因型华法林起始剂量（mg/d）[9]；见表 2。
表2
不同基因型华法林起始剂量（mg/d）
1.3 随访
术后随访3～12个月，出院后，每月1次电话随访，记录每次复查INR值、并发症发生及恢复情况，并根据INR值及临床症状、治疗情况给出建议华法林用量及复查时机。
1.4 统计学分析
所有数据均用SPSS 21.0统计软件进行统计处理，计量资料采用均数±标准差（
2 结果
A组患者术后常规给予华法林2.5 mg/d，根据INR值调整华法林用量，其中2例于术后第8 d、第12 d出现不同程度的言语不清，行头颅CT示：脑梗死，经积极治疗后，随访6个月，1例症状明显好转，1例仍表现为右侧肢体共济失调；2例术后第9 d、第16 d出现下肢疼痛，彩色超声波示：腘动脉血栓；1例术后第22 d发生肺栓塞；1例术后第12 d复查彩色超声心动图示：人工瓣膜瓣环血栓形成；14例分别于第15～20 d达到预期INR值，无明显血栓并发症。术后3个月行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测，其中17例为CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）阳性，VKORC1-1639 GA阳性；3例为CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）阳性，VKORC1-1639 GG阳性。B组患者术后第2 d给予华法林推荐量的同时给予阿司匹林（100 mg/d）及低分子肝素（0.4 ml/d），分别于第5～9 d达到华法林预期值，后停用阿司匹林及低分子肝素；随访6个月无明显血栓并发症，仅1例出现鼻腔出血并发症，经鼻孔填塞后好转。两组患者的随访结果见表 3。
表3
两组患者的随访结果［例（%）/（3 讨论
人工机械瓣膜置换术后患者均需终身服用抗凝药，目前国内一般用口服华法林抗凝治疗[10]。但与抗凝治疗有关的出血及血栓形成是心瓣膜置换术后常见且可危及生命的并发症[11]，如卡瓣，肢体栓塞、脑梗死，甚至发生猝死[10, 12]，华法林过量又易导致出血[10, 13]。而将不同患者的华法林剂量调整到既安全又有效的范围，是长期以来临床用药上一个非常棘手的问题。
华法林是由S-对映体和R-对映体组成的消旋化合物，其中，S-华法林抗凝活性是R-华法林抗凝活性的3～5倍，提供了华法林70％的抗凝活性[14-15]。两种对映体在体内被不同的细胞色素P450（cytoch-rome P450，CYP）同工酶通过羧基化代谢成非活性产物。S-华法林85％以上由CYP2C9代谢为无活性的6-羟化产物和7-羟化产物；而R-华法林主要经CYP3A4、1A1、lA2代谢[16]，对华法林剂量影响最大的是CYP2C9。
华法林通过抑制VKORC，阻止了维生素K的循环应用，使凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ以及蛋白C和S无法羧化而停留在没有抗凝活性的前体阶段，从而达到抗凝的目的。VKORC是维生素K依赖性凝血因子生成的限速酶。因此，临床上主要应用对CYP2C9及VKORC的检测来评估华法林用量。CYP2C9与VKORCl基因型分布有明显的种族差异。Yang等[17]进行的分析显示，亚洲人群中VKORCl-1639AA、AG及GG基因型频率分别为0.804，0.183和0.013，而高加索人群分别为0.163，0.489和0.367。这也是我国与西方国家华法林用量的差异所在。虽然CYP2C9及VKORC高活性在我国只占极少，但对于心瓣膜置换术后给予华法林用量却至关重要。
2008年，美国胸科医师协会（ACCP）指南[18-19]中推荐心脏机械瓣膜置换术后INR的控制范围为2.0～3.5，其中主动脉瓣置换术后INR为2.0～3.0，二尖瓣置换术后INR为2.5～3.5。目前一些国外研究建议INR控制范围低于指南推荐的范围[19-24]。关于中国人机械瓣膜置换术后患者合适的INR控制范围一直存在争议，一般认为中国人心瓣膜置换术后INR控制在1.6～2.6是合理的[25-27]。我们设置的预期INR值为1.5～2.5。而不同瓣位的心脏机械瓣置换术后患者的相对安全INR范围不同。
本组CYP2C9和VKORC1高活性患者心瓣膜置换术后的抗凝情况，其中术前行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测患者，根据上述公式计算出华法林推荐量，后根据INR值调整用量，术后血栓并发症发生率与未行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测者给予常规推荐华法林剂量相比差异有统计学意义。术前未行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测，术后1个月内有6例出现抗凝并发症，发生率高达30%，明显高于文献报道。我们认为其原因：（1）此研究主要讨论CYP2C9及VKORC高活性患者，患者本身就对华法林抗凝不敏感，与敏感者相比易发生血栓栓塞；（2）VKORC高活性患者VKORCl-1639AG及GG基因型频率为0.183和0.013，远低于VKORCl-1639AA基因型频率的0.804，属于少数人群；（3）本组并发症的发生率只代表CYP2C9和VKORC高活性患者（只占人群极少部分），因此与人群相比要高。因此，我们认为术前行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测有其必要性，对于我国大多数人其表现为CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）阳性，VKORC1-1639 AA阳性，达到治疗窗时间短，术后栓塞并发症的发生相对较少，而对那些CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）阳性，VKORC1-1639 GA/GG阳性者则需要的华法林剂量大、时间长，才能达到预期INR值，这个过程中极易发生血栓形成并发症，应提高警惕。根据我们的经验，对于CYP2C9及VKORC高活性患者术后给予华法林的同时加阿司匹林（100 mg/d）及低分子肝素（0.4 ml/d），待INR达到预期值后停用阿司匹林及低分子肝素，有其必要性。可以减少心瓣膜置换术后栓塞的发生及达到华法林治疗窗的时间。根据临床经验行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测，所计算出来的华法林推荐量部分与临床实际观察不符，实际应用华法林量不能完全依赖计算结果，因为华法林同样受饮食、药物等其他因素的影响。还要根据检测的INR值来调整用量，但是检测结果为CYP2C9及VKORC高活性者，预示着华法林用量大，达标值（INR）用时长，有很高的预测性，可以提示我们在加强抗凝的同时应用阿司匹林和肝素。有研究认为，术后早期以肝素作为华法林起效之前的抗凝治疗，进行华法林和肝素联合使用，安全性较单纯口服华法林高 [28-29]。与我们的研究结果相一致。
因此，术前检测VKORCl和CYP2C9基因多态性可以预测华法林用量，并根据结果调整抗凝方案，有助于减少心瓣膜置换术后抗凝治疗所引起的栓塞并发症。
