引用本文： 刘凯, 史凌云, 王苏龙, 艾尼孜尔·亚力坤, 伊木让·哈米提, 艾合买提江·玉素甫. “手风琴”技术与去铁胺促进牵张成骨区骨再生效果的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2024, 38(8): 1001-1009. doi: 10.7507/1002-1892.202404073 复制
随着对牵张成骨（distraction osteogenesis，DO）的不断验证和探索，研究发现“手风琴”技术（accordion technique，AT）是促进血管化成骨并缩短DO矿化期的有效方法[1-3]，其通过外部循环轴向压缩-牵拉应力刺激诱导内源性骨再生。我们前期研究发现，在DO矿化中期通过施加循环应力刺激可诱导牵张区局部低氧，激活缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）/VEGF信号通路，有效增强牵张区骨再生与重建[4-5]。然而，漫长的治疗周期、复杂的干预方法和高昂的费用仍制约着上述技术的发展及应用[6-8]。
近年来，诱导骨再生区域微血管形成的相关调控机制逐渐成为研究热点，丰富的血管长入除能提供有助于骨再生和重建的营养物质外，还能与新骨形成中的多种复杂机制形成时间和空间上的相互依赖。组织缺氧已被证实是微血管生成的关键驱动力，并受HIF-1α/VEGF信号通路的调控[9]。该通路激活后可刺激前成骨细胞簇的募集，如BMSCs、巨噬细胞及多种生长因子，并调节再生骨骼的功能。去铁胺（deferoxamine，DFO）是缺氧模拟物的一种铁螯合剂，已被证明可间接稳定HIF-1α的活性并使其积累，从而激活HIF-1α/VEGF信号通路诱导微血管生成，加速牵张区骨再生[2, 10-11]。
但对于AT技术以及DFO，哪种更有利于牵张区骨再生与重建且易于临床应用仍未明确。为此，我们通过建立大鼠股骨DO模型，比较DO矿化中期给予牵张区灌注DFO或采用AT技术的促成骨效果，动态观察牵张区骨再生过程，为验证激活HIF-1α/VEGF信号通路促进牵张区骨重建提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
45只SPF级成年雄性SD大鼠，体质量（400.0±20.7）g，由新疆医科大学实验动物中心提供。
1.5%异氟烷（上海雅培制药有限公司）；2%戊巴比妥钠、DFO（Sigma公司，美国）；HIF-1α抗体、VEGF抗体、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）抗体、骨钙素（osteocalcin，OCN）抗体、羊抗小鼠/兔二抗（Abcam公司，英国)；HIF-1α、VEGF、CD31及成骨相关转录因子（Osterix） ELISA试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）。
自制微型延长型外固定架（50.0 mm×12.0 mm×12.0 mm）；光镜（Olympus公司，日本）；电子分析天平（Sartorius公司，德国）；三点弯曲力学试验机（深圳瑞格尔仪器有限公司）；数字X线机（Toshiba公司，日本）；Micro-CT机（Bruker公司，德国）；病理切片机（Leica公司，德国）。
1.2 实验分组及方法
参考本团队前期研究方法制备大鼠右侧股骨DO模型[4-5]。45只大鼠经腹腔注射2%戊巴比妥钠（3 mg/100 g）麻醉后，于右后大腿中段外侧作一纵切口，逐层切开皮肤、皮下组织，在股外侧肌与股直肌间隙进入，暴露股骨中段，以此为截骨平面，在其近、远端各打入2枚克氏针（直径1.2 mm，长度250 mm），安装自制微型延长型外固定架；微型摆锯截骨，组装并调试外固定架。生理盐水冲洗术区、止血，依次缝合筋膜和皮肤。术后单笼饲养大鼠，每天腹腔注射青霉素20万U/kg，持续7 d。
参照随机数字表法，将大鼠模型分为对照组、DFO组及AT组（n=15）。各组截骨术后5 d内（潜伏期）均不作特殊处理，5 d后开始以0.25 mm/12 h速度持续延长10 d（牵张期），牵张完成后即进入矿化期。其中，对照组矿化期内不作干预。DFO组于矿化第3周开始灌注DFO，具体方法：采用生理盐水制备DFO溶液（5 μg/100 μL）；使用1.5%异氟烷封闭麻醉技术对大鼠行短效麻醉后，于牵张区局部灌注DFO，每2天1次，每次300 μL ，持续10 d[4]。AT组于矿化第3周开始给予循环应力刺激，速度0.25 mm/12 h，压缩5 d后牵张5 d[2]。
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
截骨术后观察各组大鼠存活情况，以及矿化期DFO组及AT组进行相应处理后有无感染、不适等特殊情况发生。
1.3.2 X线片观察
于牵张期结束及矿化第2、4、6周，各组大鼠摄股骨正位X线片[12]，观察牵张区钙化情况。
1.3.3 ELISA检测
矿化第4、6周，3组各取5只大鼠，同上法腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉后，于心脏穿刺抽血2 mL。室温下，以离心半径10.2 cm，1 500 r/min离心15 min；取血清标本，按HIF-1α、VEGF、CD31及Osterix ELISA试剂盒检测标准步骤，测量450 nm波长处吸光度（A）值并计算各样本浓度值。
1.3.4 大体观察
矿化第4、6周，5只取血后大鼠给予过量麻醉安乐死，按照原切口入路取股骨标本，观察牵张区骨皮质外形及连续性。
1.3.5 Micro-CT观测
矿化第6周大体观察后，各组取3只大鼠实验侧股骨标本行Micro-CT扫描，使用CT机配套Skyscan CTAn定量分析软件测量牵张区新生骨骨密度（bone mineral density，BMD）、骨体积/组织体积（bone volume/tissue volume，BV/TV）、骨小梁疏密度（trabecular separation，Tb.Sp）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）及骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）。
1.3.6 生物力学测试
矿化第6周，各组取5只大鼠双侧股骨标本行三点弯曲生物力学测试。将股骨水平放置于三点弯曲力学试验机跨距为18 mm的两支点上，以0.5 mm/min加载速度在股骨正中施加垂直向下的压力载荷直至股骨标本断裂，记录载荷、变形数据并计算极限载荷、弹性模量、断裂能量及刚度，以实验侧与正常侧比值行组间比较。
1.3.7 组织学及免疫组织化学染色观察
将矿化第4周大体观察后及第6周Micro-CT检测后的股骨标本，置于12%乙二胺四乙酸液脱钙4周后石蜡包埋。去除石蜡后使用病理切片机制备5 μm厚切片，按照标准操作步骤行组织学染色（HE染色）及免疫组织化学染色（HIF-1α、VEGF、OCN、OPN）。光镜下免疫组织化学染色阳性表达区域或细胞呈棕褐色，于200倍镜下切片随机取3个视野，采用Image Pro Plus 6.0软件行半定量分析。
1.4 统计学方法
采用SPSS21.0统计软件进行分析，GraphPad Prism 9.0软件绘制图表。计量资料经Shapiro-Wilk检验均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
截骨术后3组大鼠均存活至实验完成。矿化期DFO组以及AT组进行相应处理期间无实验侧肢体感染以及大鼠不适等情况发生。
2.2 X线片观察
牵张期结束时3组截骨线平直，牵张区长度为5 mm。矿化第2周，3组牵张区均可见云雾状低密度钙化影，组间无显著差异。矿化第4周，3组牵张区均可见大量新骨生成及高密度钙化影，但DFO组、AT组间隙内新骨钙化影密度优于对照组；与DFO组相比，AT组牵张区可见双侧骨皮质形成，连续性更好。矿化第6周， DFO组和AT组牵张区两侧均存在骨皮质并连接两端截骨线，AT组髓腔重建优于DFO组；而对照组牵张区中央区呈现不连接。见图1。
2.3 ELISA检测
矿化第4、6周，AT组血清中HIF-1α、VEGF、CD31及Osterix含量均高于DFO组、对照组，DFO组高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2。
表表 1
3组结局指标组间比较（x±s）
Table表 1.
Comparison of outcome indicators between groups (x±s)
表表 2
3组结局指标两两比较
Table表 2.
Pairwise comparison of outcome indicators in 3 groups
2.4 大体观察
矿化第4周，AT组牵张区形成连续骨皮质和少量不成熟新生骨痂且髓腔开始重建；DFO组及对照组牵张区存在不连续骨皮质和不成熟新生骨痂，髓腔未开始重建。矿化第6周，DFO组和AT组牵张区两侧可见完整骨皮质连接，而对照组间隙两侧未形成成熟骨皮质且中央区存在断裂线；AT组髓腔部分再通，DFO组和对照组髓腔未通且仍存在纤维结缔组织。见图2。
2.5 Micro-CT及生物力学测试
矿化第6周，股骨Micro-CT扫描示AT组髓腔再通，牵张区骨皮质连续；DFO组及对照组未见完全再通髓腔。AT组牵张区新生骨BMD、BV/TV、Tb.Sp、Tb.N及Tb.Th均高于DFO组和对照组，DFO组高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。生物力学测试示AT组极限载荷、弹性模量、断裂能量和刚度均优于DFO组和对照组，DFO组优于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图3及表1、2。
2.6 组织学观察
矿化第4周，AT组牵张区可见成纤维细胞和前成骨细胞增生活跃，微血管爬行扩张，形成丰富的新生骨痂。DFO组虽然可见增殖的前成骨细胞，但微血管爬行区域少于AT组。对照组牵张区前成骨细胞及微血管分布较DFO组和AT组稀疏。见图4a。
矿化第6周，AT组牵张区骨髓腔重建且完全再通，DFO组髓腔部分再通，而对照组牵张区仍观察到成纤维细胞及前成骨细胞分布，髓腔未再通。见图4b。
2.7 免疫组织化学染色观察
矿化第4周，牵张区HIF-1α、VEGF、OCN、OPN阳性染色区域AT组最多，其次为DFO组，对照组最少。矿化第6周，AT组及DFO组牵张区因新生骨痂矿化及髓腔重建，上述指标阳性染色区域减少；对照组牵张区新生骨痂矿化及髓腔重建缓慢，上述阳性染色区域仍较多。见图5。
矿化第4周，AT组牵张区HIF-1α、VEGF、OCN、OPN表达量均高于DFO组和对照组， DFO组高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。而矿化第6周，AT组上述指标表达量均低于DFO组和对照组；DFO组仅HIF-1α表达量低于对照组，而VEGF、OCN、OPN更高；但组间差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1、2。
3 讨论
牵张区再生骨痂组织中的微血管生成、爬行及连接成网是DO过程中骨再生成功的关键[12]。目前，国内外大量研究在DO过程中使用缺氧模拟物增强机械力刺激骨再生，但缺氧模拟物种类、用量仍缺乏统一标准，造成该干预措施适用性仍未明确[13]。DFO为铁螯合剂，可与人体内铁离子结合促使铁排泄，常为铁超负荷疾病治疗的主要措施。Zhu等[14]采用DFO治疗大鼠肺损伤的研究发现，DFO通过螯合铁离子、抑制黄嘌呤氧化酶活性途径，减少活性氧生成，提示其能抑制氧化应激反应。此外，DFO也可通过铁螯合间接稳定HIF-1α活性，促进HIF-1α表达增多的同时驱使其进入细胞核形成复合物，并与HIF-1β结合形成具有活性的HIF-1复合物，通过HIF响应元件（HRE）启动一系列成血管基因的转录，包括血管生成素1、VEGF、TGF-β等。本课题组前期研究发现，在大鼠DO矿化中期局部给予DFO，每2天1次，每次15 μg，有利于骨再生[4]。本次研究结果显示，通过在矿化期给予牵张区局部注射DFO后，骨再生区域形成更多的微血管及骨小梁，再生骨质量也显著优于对照组，表明DFO可有效促进骨再生区域低氧环境形成，并激活成血管-成骨耦联加速骨重建。尽管DFO干预可获得满意的骨再生结果，但需解决有创操作、多次干预、缺乏标准剂量等问题，以便于临床应用。
适宜的力学刺激环境在骨形成过程中也起着至关重要的作用，且机械力刺激可将成骨细胞聚集在受力活跃区域，从而使再生骨可适应该骨质健康状态下所能承受的力学负荷[15-16]。外部机械应力诱导骨再生过程归因于张力对牵张区内微血管形成及成骨干细胞募集和增殖的间接低氧环境刺激作用[14]。Wang等[16]比较了AT技术和单纯压缩技术治疗兔萎缩性骨折不愈合的效果，发现AT技术干预可促进骨折端大量骨痂形成。Liu等[2]和Xu等[17]研究发现，在DO矿化中期进行高频率、低幅度的循环应力刺激可激活HIF-1α/VEGF信号通路，有效促进牵张区再生骨形成、矿化和重建。基于前期研究基础[2]，本次研究选择AT方案为于矿化中期以压缩5 d后牵张5 d、速度0.25 mm/12 h进行干预。X线片、Micro-CT扫描、生物力学及组织学染色结果显示，循环应力刺激可通过激活HIF-1α/VEGF信号通路促进牵张区新骨形成及重建，且其促成骨再生和重建能力优于灌注DFO。究其原因，我们认为是低幅度的循环机械应力刺激过程引起牵张区低氧及增加HIF-1α活性程度强于灌注DFO过程，从而促进VEGF高表达，以增加牵张区新血管密度，改善骨痂组织的氧供应，促进成骨。此外，机械应力刺激遵循先压缩后牵张顺序及高频率、低幅度牵张强度，也是获得满意骨再生关键。
在成骨细胞增殖、分化和骨重建过程中，HIF-1α、VEGF、CD31和Sp7/Osterix是成血管标志物，OCN和OPN是成骨标志物[18]。既往DO动物模型研究已发现，成血管及成骨标志物水平在矿化前4周逐渐增加，随着再生骨矿化和髓腔重建，上述标志物表达水平逐渐下降。本次研究结果示矿化第4周时，AT组血清中HIF-1α、VEGF、CD31和Osterix含量显著高于DFO组和对照组（P<0.05），免疫组织化学染色半定量分析也显示HIF-1α、VEGF、OCN和OPN表达量显著高于DFO组和对照组（P<0.05）。然而随着牵张区再生骨组织成熟和重建，在矿化第6周时AT组上述成骨标志物逐渐降低，但血清中成血管标志物表达水平仍显著高于DFO组和对照组（P<0.05），这可能是由于牵张区骨形成逐渐被替代为骨重建，破骨细胞活动增强促使髓腔再通引起。因此，与DFO组相比，AT组干预措施对于提升牵张区成血管及成骨活性更有效，并可更早获得满意的骨再生与重建效果。
综上述，DO矿化中期牵张区局部灌注DFO及采用AT技术循环应力刺激均可激活HIF-1α/VEGF信号通路，加速成血管-成骨耦联及骨重建，但后者效果更优，且操作简便更易于临床应用，提示其有助于缩短患者戴架时间，从而减少并发症发生。但本研究样本量有限且为动物实验，有待大样本量动物实验联合体外细胞实验研究，验证不同干预方式促进牵张区骨再生与重建的有效性以及临床适用性。
志谢 新疆医科大学第一附属医院骨科中心显微修复外科培训中心提供实验平台及卓菲娅护士长的指导
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经新疆医科大学第一附属医院动物实验医学伦理委员会批准（IACUC-20200318-82）；实验动物使用许可证号：SYXK（新）2018-0003
作者贡献声明 刘凯、史凌云：研究实施及论文撰写；王苏龙、艾尼孜尔·亚力坤、伊木让·哈米提：数据整理、统计学分析；艾合买提江·玉素甫：研究指导、论文修改及经费支持
随着对牵张成骨（distraction osteogenesis，DO）的不断验证和探索，研究发现“手风琴”技术（accordion technique，AT）是促进血管化成骨并缩短DO矿化期的有效方法[1-3]，其通过外部循环轴向压缩-牵拉应力刺激诱导内源性骨再生。我们前期研究发现，在DO矿化中期通过施加循环应力刺激可诱导牵张区局部低氧，激活缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）/VEGF信号通路，有效增强牵张区骨再生与重建[4-5]。然而，漫长的治疗周期、复杂的干预方法和高昂的费用仍制约着上述技术的发展及应用[6-8]。
近年来，诱导骨再生区域微血管形成的相关调控机制逐渐成为研究热点，丰富的血管长入除能提供有助于骨再生和重建的营养物质外，还能与新骨形成中的多种复杂机制形成时间和空间上的相互依赖。组织缺氧已被证实是微血管生成的关键驱动力，并受HIF-1α/VEGF信号通路的调控[9]。该通路激活后可刺激前成骨细胞簇的募集，如BMSCs、巨噬细胞及多种生长因子，并调节再生骨骼的功能。去铁胺（deferoxamine，DFO）是缺氧模拟物的一种铁螯合剂，已被证明可间接稳定HIF-1α的活性并使其积累，从而激活HIF-1α/VEGF信号通路诱导微血管生成，加速牵张区骨再生[2, 10-11]。
但对于AT技术以及DFO，哪种更有利于牵张区骨再生与重建且易于临床应用仍未明确。为此，我们通过建立大鼠股骨DO模型，比较DO矿化中期给予牵张区灌注DFO或采用AT技术的促成骨效果，动态观察牵张区骨再生过程，为验证激活HIF-1α/VEGF信号通路促进牵张区骨重建提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
45只SPF级成年雄性SD大鼠，体质量（400.0±20.7）g，由新疆医科大学实验动物中心提供。
1.5%异氟烷（上海雅培制药有限公司）；2%戊巴比妥钠、DFO（Sigma公司，美国）；HIF-1α抗体、VEGF抗体、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）抗体、骨钙素（osteocalcin，OCN）抗体、羊抗小鼠/兔二抗（Abcam公司，英国)；HIF-1α、VEGF、CD31及成骨相关转录因子（Osterix） ELISA试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）。
自制微型延长型外固定架（50.0 mm×12.0 mm×12.0 mm）；光镜（Olympus公司，日本）；电子分析天平（Sartorius公司，德国）；三点弯曲力学试验机（深圳瑞格尔仪器有限公司）；数字X线机（Toshiba公司，日本）；Micro-CT机（Bruker公司，德国）；病理切片机（Leica公司，德国）。
1.2 实验分组及方法
参考本团队前期研究方法制备大鼠右侧股骨DO模型[4-5]。45只大鼠经腹腔注射2%戊巴比妥钠（3 mg/100 g）麻醉后，于右后大腿中段外侧作一纵切口，逐层切开皮肤、皮下组织，在股外侧肌与股直肌间隙进入，暴露股骨中段，以此为截骨平面，在其近、远端各打入2枚克氏针（直径1.2 mm，长度250 mm），安装自制微型延长型外固定架；微型摆锯截骨，组装并调试外固定架。生理盐水冲洗术区、止血，依次缝合筋膜和皮肤。术后单笼饲养大鼠，每天腹腔注射青霉素20万U/kg，持续7 d。
参照随机数字表法，将大鼠模型分为对照组、DFO组及AT组（n=15）。各组截骨术后5 d内（潜伏期）均不作特殊处理，5 d后开始以0.25 mm/12 h速度持续延长10 d（牵张期），牵张完成后即进入矿化期。其中，对照组矿化期内不作干预。DFO组于矿化第3周开始灌注DFO，具体方法：采用生理盐水制备DFO溶液（5 μg/100 μL）；使用1.5%异氟烷封闭麻醉技术对大鼠行短效麻醉后，于牵张区局部灌注DFO，每2天1次，每次300 μL ，持续10 d[4]。AT组于矿化第3周开始给予循环应力刺激，速度0.25 mm/12 h，压缩5 d后牵张5 d[2]。
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
截骨术后观察各组大鼠存活情况，以及矿化期DFO组及AT组进行相应处理后有无感染、不适等特殊情况发生。
1.3.2 X线片观察
于牵张期结束及矿化第2、4、6周，各组大鼠摄股骨正位X线片[12]，观察牵张区钙化情况。
1.3.3 ELISA检测
矿化第4、6周，3组各取5只大鼠，同上法腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉后，于心脏穿刺抽血2 mL。室温下，以离心半径10.2 cm，1 500 r/min离心15 min；取血清标本，按HIF-1α、VEGF、CD31及Osterix ELISA试剂盒检测标准步骤，测量450 nm波长处吸光度（A）值并计算各样本浓度值。
1.3.4 大体观察
矿化第4、6周，5只取血后大鼠给予过量麻醉安乐死，按照原切口入路取股骨标本，观察牵张区骨皮质外形及连续性。
1.3.5 Micro-CT观测
矿化第6周大体观察后，各组取3只大鼠实验侧股骨标本行Micro-CT扫描，使用CT机配套Skyscan CTAn定量分析软件测量牵张区新生骨骨密度（bone mineral density，BMD）、骨体积/组织体积（bone volume/tissue volume，BV/TV）、骨小梁疏密度（trabecular separation，Tb.Sp）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）及骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）。
1.3.6 生物力学测试
矿化第6周，各组取5只大鼠双侧股骨标本行三点弯曲生物力学测试。将股骨水平放置于三点弯曲力学试验机跨距为18 mm的两支点上，以0.5 mm/min加载速度在股骨正中施加垂直向下的压力载荷直至股骨标本断裂，记录载荷、变形数据并计算极限载荷、弹性模量、断裂能量及刚度，以实验侧与正常侧比值行组间比较。
1.3.7 组织学及免疫组织化学染色观察
将矿化第4周大体观察后及第6周Micro-CT检测后的股骨标本，置于12%乙二胺四乙酸液脱钙4周后石蜡包埋。去除石蜡后使用病理切片机制备5 μm厚切片，按照标准操作步骤行组织学染色（HE染色）及免疫组织化学染色（HIF-1α、VEGF、OCN、OPN）。光镜下免疫组织化学染色阳性表达区域或细胞呈棕褐色，于200倍镜下切片随机取3个视野，采用Image Pro Plus 6.0软件行半定量分析。
1.4 统计学方法
采用SPSS21.0统计软件进行分析，GraphPad Prism 9.0软件绘制图表。计量资料经Shapiro-Wilk检验均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
截骨术后3组大鼠均存活至实验完成。矿化期DFO组以及AT组进行相应处理期间无实验侧肢体感染以及大鼠不适等情况发生。
2.2 X线片观察
牵张期结束时3组截骨线平直，牵张区长度为5 mm。矿化第2周，3组牵张区均可见云雾状低密度钙化影，组间无显著差异。矿化第4周，3组牵张区均可见大量新骨生成及高密度钙化影，但DFO组、AT组间隙内新骨钙化影密度优于对照组；与DFO组相比，AT组牵张区可见双侧骨皮质形成，连续性更好。矿化第6周， DFO组和AT组牵张区两侧均存在骨皮质并连接两端截骨线，AT组髓腔重建优于DFO组；而对照组牵张区中央区呈现不连接。见图1。
2.3 ELISA检测
矿化第4、6周，AT组血清中HIF-1α、VEGF、CD31及Osterix含量均高于DFO组、对照组，DFO组高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2。
表表 1
3组结局指标组间比较（x±s）
Table表 1.
Comparison of outcome indicators between groups (x±s)
表表 2
3组结局指标两两比较
Table表 2.
Pairwise comparison of outcome indicators in 3 groups
2.4 大体观察
矿化第4周，AT组牵张区形成连续骨皮质和少量不成熟新生骨痂且髓腔开始重建；DFO组及对照组牵张区存在不连续骨皮质和不成熟新生骨痂，髓腔未开始重建。矿化第6周，DFO组和AT组牵张区两侧可见完整骨皮质连接，而对照组间隙两侧未形成成熟骨皮质且中央区存在断裂线；AT组髓腔部分再通，DFO组和对照组髓腔未通且仍存在纤维结缔组织。见图2。
2.5 Micro-CT及生物力学测试
矿化第6周，股骨Micro-CT扫描示AT组髓腔再通，牵张区骨皮质连续；DFO组及对照组未见完全再通髓腔。AT组牵张区新生骨BMD、BV/TV、Tb.Sp、Tb.N及Tb.Th均高于DFO组和对照组，DFO组高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。生物力学测试示AT组极限载荷、弹性模量、断裂能量和刚度均优于DFO组和对照组，DFO组优于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图3及表1、2。
2.6 组织学观察
矿化第4周，AT组牵张区可见成纤维细胞和前成骨细胞增生活跃，微血管爬行扩张，形成丰富的新生骨痂。DFO组虽然可见增殖的前成骨细胞，但微血管爬行区域少于AT组。对照组牵张区前成骨细胞及微血管分布较DFO组和AT组稀疏。见图4a。
矿化第6周，AT组牵张区骨髓腔重建且完全再通，DFO组髓腔部分再通，而对照组牵张区仍观察到成纤维细胞及前成骨细胞分布，髓腔未再通。见图4b。
2.7 免疫组织化学染色观察
矿化第4周，牵张区HIF-1α、VEGF、OCN、OPN阳性染色区域AT组最多，其次为DFO组，对照组最少。矿化第6周，AT组及DFO组牵张区因新生骨痂矿化及髓腔重建，上述指标阳性染色区域减少；对照组牵张区新生骨痂矿化及髓腔重建缓慢，上述阳性染色区域仍较多。见图5。
矿化第4周，AT组牵张区HIF-1α、VEGF、OCN、OPN表达量均高于DFO组和对照组， DFO组高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。而矿化第6周，AT组上述指标表达量均低于DFO组和对照组；DFO组仅HIF-1α表达量低于对照组，而VEGF、OCN、OPN更高；但组间差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1、2。
3 讨论
牵张区再生骨痂组织中的微血管生成、爬行及连接成网是DO过程中骨再生成功的关键[12]。目前，国内外大量研究在DO过程中使用缺氧模拟物增强机械力刺激骨再生，但缺氧模拟物种类、用量仍缺乏统一标准，造成该干预措施适用性仍未明确[13]。DFO为铁螯合剂，可与人体内铁离子结合促使铁排泄，常为铁超负荷疾病治疗的主要措施。Zhu等[14]采用DFO治疗大鼠肺损伤的研究发现，DFO通过螯合铁离子、抑制黄嘌呤氧化酶活性途径，减少活性氧生成，提示其能抑制氧化应激反应。此外，DFO也可通过铁螯合间接稳定HIF-1α活性，促进HIF-1α表达增多的同时驱使其进入细胞核形成复合物，并与HIF-1β结合形成具有活性的HIF-1复合物，通过HIF响应元件（HRE）启动一系列成血管基因的转录，包括血管生成素1、VEGF、TGF-β等。本课题组前期研究发现，在大鼠DO矿化中期局部给予DFO，每2天1次，每次15 μg，有利于骨再生[4]。本次研究结果显示，通过在矿化期给予牵张区局部注射DFO后，骨再生区域形成更多的微血管及骨小梁，再生骨质量也显著优于对照组，表明DFO可有效促进骨再生区域低氧环境形成，并激活成血管-成骨耦联加速骨重建。尽管DFO干预可获得满意的骨再生结果，但需解决有创操作、多次干预、缺乏标准剂量等问题，以便于临床应用。
适宜的力学刺激环境在骨形成过程中也起着至关重要的作用，且机械力刺激可将成骨细胞聚集在受力活跃区域，从而使再生骨可适应该骨质健康状态下所能承受的力学负荷[15-16]。外部机械应力诱导骨再生过程归因于张力对牵张区内微血管形成及成骨干细胞募集和增殖的间接低氧环境刺激作用[14]。Wang等[16]比较了AT技术和单纯压缩技术治疗兔萎缩性骨折不愈合的效果，发现AT技术干预可促进骨折端大量骨痂形成。Liu等[2]和Xu等[17]研究发现，在DO矿化中期进行高频率、低幅度的循环应力刺激可激活HIF-1α/VEGF信号通路，有效促进牵张区再生骨形成、矿化和重建。基于前期研究基础[2]，本次研究选择AT方案为于矿化中期以压缩5 d后牵张5 d、速度0.25 mm/12 h进行干预。X线片、Micro-CT扫描、生物力学及组织学染色结果显示，循环应力刺激可通过激活HIF-1α/VEGF信号通路促进牵张区新骨形成及重建，且其促成骨再生和重建能力优于灌注DFO。究其原因，我们认为是低幅度的循环机械应力刺激过程引起牵张区低氧及增加HIF-1α活性程度强于灌注DFO过程，从而促进VEGF高表达，以增加牵张区新血管密度，改善骨痂组织的氧供应，促进成骨。此外，机械应力刺激遵循先压缩后牵张顺序及高频率、低幅度牵张强度，也是获得满意骨再生关键。
在成骨细胞增殖、分化和骨重建过程中，HIF-1α、VEGF、CD31和Sp7/Osterix是成血管标志物，OCN和OPN是成骨标志物[18]。既往DO动物模型研究已发现，成血管及成骨标志物水平在矿化前4周逐渐增加，随着再生骨矿化和髓腔重建，上述标志物表达水平逐渐下降。本次研究结果示矿化第4周时，AT组血清中HIF-1α、VEGF、CD31和Osterix含量显著高于DFO组和对照组（P<0.05），免疫组织化学染色半定量分析也显示HIF-1α、VEGF、OCN和OPN表达量显著高于DFO组和对照组（P<0.05）。然而随着牵张区再生骨组织成熟和重建，在矿化第6周时AT组上述成骨标志物逐渐降低，但血清中成血管标志物表达水平仍显著高于DFO组和对照组（P<0.05），这可能是由于牵张区骨形成逐渐被替代为骨重建，破骨细胞活动增强促使髓腔再通引起。因此，与DFO组相比，AT组干预措施对于提升牵张区成血管及成骨活性更有效，并可更早获得满意的骨再生与重建效果。
综上述，DO矿化中期牵张区局部灌注DFO及采用AT技术循环应力刺激均可激活HIF-1α/VEGF信号通路，加速成血管-成骨耦联及骨重建，但后者效果更优，且操作简便更易于临床应用，提示其有助于缩短患者戴架时间，从而减少并发症发生。但本研究样本量有限且为动物实验，有待大样本量动物实验联合体外细胞实验研究，验证不同干预方式促进牵张区骨再生与重建的有效性以及临床适用性。
志谢 新疆医科大学第一附属医院骨科中心显微修复外科培训中心提供实验平台及卓菲娅护士长的指导
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经新疆医科大学第一附属医院动物实验医学伦理委员会批准（IACUC-20200318-82）；实验动物使用许可证号：SYXK（新）2018-0003
作者贡献声明 刘凯、史凌云：研究实施及论文撰写；王苏龙、艾尼孜尔·亚力坤、伊木让·哈米提：数据整理、统计学分析；艾合买提江·玉素甫：研究指导、论文修改及经费支持
