引用本文： 邬建飞, 王丙龙, 刘宇, 魏岱旭. 功能化聚羟基脂肪酸酯微球的制备及其抗菌、促成骨分化功能评价. 中国修复重建外科杂志, 2023, 37(8): 929-936. doi: 10.7507/1002-1892.202303136 复制
受伤或疾病导致的骨缺损是骨科领域巨大挑战，传统治疗方式以自体骨移植为主，但存在来源有限、供区继发性损伤、慢性疼痛和感染等问题。骨组织工程技术成为骨修复理想策略[1]，但研究发现骨组织工程支架植入可能导致细菌感染、炎症、免疫排斥反应等问题，严重影响材料与骨组织融合，抑制新骨生长，因此设计同时具备促成骨分化和良好抗菌性的新型工程化材料显得尤为重要[2-4]。BMP-2是强效骨诱导生长因子，能够有效促进骨祖细胞募集、生长和矿化[5-6]。最近发现的人β防御素3（human β-defensin 3，HBD3）具有较强广谱抗菌性和低毒性，已广泛用于抗菌研究[7]。Liu等[8]研究表明BMP-2结合HBD3可以同时满足骨组织工程支架促成骨分化和抗菌性要求。
另一方面，良好的生物相容性是骨组织工程支架必不可少的属性。聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA）是一类基于合成生物学平台，由细菌合成、可生物降解的天然聚酯材料，具有良好生物相容性。同时PHA为典型疏水性材料，制备的微球对疏水性药物表现出较高的药物运载能力和稳定释放能力，有利于负载药物发挥作用[5, 9-12]。西北大学生命科学与医学部魏岱旭团队前期自创的大豆磷脂（soybean lecithin，SL）介导的生长因子修饰技术（SL-mediated introduction of growth factors into polyesters，SMIGP）[4, 6]，进一步实现了PHA对生长因子等蛋白的高效负载。迄今已有6种商用PHA（PHB、P4HB、PHBV、PHBHHx、P34HB和PBVHx）用于骨组织工程研究，其中PBVHx（又称PHBVHHx）的生物相容性最佳[9-10]。本研究拟将BMP-2和HBD3两种蛋白负载于PBVHx，再利用微流控技术制备适用于微创手术的可注射微球，以解决骨组织工程材料植入后出现的骨组织感染和成骨分化慢等难题。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
PBVHx（北京蓝晶微生物科技有限公司）；SL、BMP-2、HBD3及其ELISA试剂盒（Sigma-Aldrich公司，美国）；DMEM、FBS及青、链霉素双抗（GIBCO公司，美国）；Alexa FluorTM 555-鬼笔环肽、Ⅰ型胶原蛋白（collagen type Ⅰ，COL-1）一抗、二抗及DAPI（Thermo Fisher公司，美国）；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为本实验室保存；ALP活性试剂盒、蛋白质测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；LIVE/DEADTM BacLightTM试剂盒、LIVE/DEADTM Cell Imaging Kit试剂盒、细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8）（Invitrogen公司，美国）；OriCell® 成人BMSCs完全培养基、人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）［赛业（广州）生物科技有限公司］。
激光共聚焦显微镜（Leica公司，德国）；CO2细胞培养箱（力康生物医疗科技控股有限公司）；扫描电镜（FEI公司，捷克）；多功能酶标仪、紫外分光光度计（Thermo Scientific公司，美国）；Transwell（Corning公司，美国）。
1.2 微球制备
采用SMIGP技术制备SL-BMP-2（sBMP-2）和SL-HBD3（sHBD3）[4, 6]。将10 ng SL分别与50 ng BMP-2或30 ng HBD3溶解于含5%（V/V）醋酸的DMSO中，30℃慢磁搅拌24 h；冻干12 h除去溶剂，分别得到sBMP-2和sHBD3。将12 μg sBMP-2（约含10 μg BMP-2）、0.8 μg sHBD3（约含0.6 μg HBD3）和1 g PBVHx溶解于40 mL二氯甲烷中，形成油相（sBMP-2/sHBD3/PBVHx溶液）。将0.1 g 聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）溶于100 mL超纯水（0.1%，W/V）， 80℃慢磁搅拌2 h，形成水相（PVA溶液）。室温下，将油相和水相连接于注射器，两端连接8号不锈钢针头与微流推注泵，推进速度分别为油相0.05 mL/min、水相2 mL/min，获得含BMP-2及HBD3的功能化PHA微球（functional microsphere，f-PMS）。同法制备未添加BMP-2及HBD3的单纯PHA微球（pure microsphere，p-PMS）作为对照。f-PMS具体制备流程见图1。
图1
f-PMS制备流程和药物释放示意图
Figure1.
Schematic of preparation and drug release of f-PHA
1.3 微球观测
1.3.1 微球理化特性表征
① 微球微观形貌观测：采用扫描电镜在15 kV条件下观察两种微球表面结构及直径。
② 吸水率检测：取两种干燥微球称重记为Wd，置于纯水中24 h后取出，用滤纸吸干表面水分后称重，记为Ww。每种微球设定4个平行样品，按照以下公式计算微球吸水率：吸水率=（Ww–Wd）/Wd×100%。
③ 药物体外释放实验：取1 g f-PMS置于含40 mL PBS的50 mL离心管中，37℃、150 r/min恒温摇床处理30 d；期间分别于第0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30天收集PBS，采用ELISA检测试剂盒检测BMP-2及HBD3浓度。按照以下公式计算累积释放率：累积释放率=C1/C0×100%，其中C0表示样品中HBD3或BMP-2理论总浓度，C1为上述各时间点浓度。
1.3.2 微球抗菌能力评估
采用LB培养基制备起始细菌浊度为0.2的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬液，各取10 mL置于15 mL无菌离心管，分别加入0.5 g f-PMS和p-PMS。37℃、200 r/min恒温摇床培养12、24 h时，采用紫外分光光度计于600 nm处测量吸光度（A）值，表示细菌浊度。同时，经LIVE/DEADTM BacLightTM试剂盒染色处理后，激光共聚焦显微镜下观察细菌情况，绿色荧光为活细菌，红色荧光为死细菌。
1.3.3 微球生物相容性评估
将1×105个hBMSCs接种于Transwell底部的24孔板，分别将10 mg f-PMS和p-PMS放置于Transwell小室中，同时以未添加微球为空白组；使用OriCell®成人BMSCs完全培养基于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，隔天换液。培养24、48 h时，加入10%CCK-8后再培养2 h，使用紫外分光光度计测量405 nm处A值，按照以下公式计算细胞相对增殖率：细胞相对增殖率=实验组A值/空白组A值×100%，实验重复6次。使用LIVE/DEADTM Cell Imaging Kit试剂盒对微球表面上的细胞进行染色，并利用激光共聚焦显微镜观察细胞存活情况，活细胞呈绿色染色，死细胞呈红色染色。
1.3.4 微球对hBMSCs成骨分化的影响
将hBMSCs接种于含细胞爬片的24孔板中，每孔1×104个细胞，分别将10 mg f-PMS和p-PMS放置于Transwell小室中（以未添加微球组为空白组），使用OriCell®成人BMSCs完全培养基于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，隔天换液，并持续培养10 d。
① COL-1免疫荧光染色观察：培养后10 d取细胞经4%多聚甲醛固定、0.1% Triton X-100渗透、3% 牛血清白蛋白室温封闭；每孔加入450 μL COL-1一抗（1∶250，1%牛血清白蛋白-PBS溶液稀释），湿盒4℃过夜孵育，PBS 清洗3 次；与二抗室温孵育1 h，PBS 洗涤3 次；最后使用DAPI、Alexa FluorTM 555-鬼笔环肽染色后，滴加适量抗荧光淬灭剂封片，激光共聚焦显微镜下观察COL-1表达，并采用显微镜自带软件分析相对荧光强度。实验重复3次。
②ALP活性检测：于培养后5、10 d取hBMSCs，参照ALP活性试剂盒和蛋白质测定试剂盒操作说明书检测细胞中ALP总活性和总蛋白含量，两者比值即为单位蛋白中ALP含量。实验重复3次。
1.4 统计学方法
采用GraphPad Prism 6.0统计软件进行分析。计量资料行正态性检验，均符合正态分布，以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 微球理化特性表征
2.1.1 微球微观形貌
扫描电镜观察示p-PMS和f-PMS两种微球直径相近，分别为（108.95±8.12）μm和（106.70±9.39）μm。其中，p-PMS表面粗糙，分布着直径为1～3 μm的孔隙；而f-PMS表面更光滑，且负载大量BMP-2和HBD3白色颗粒状物质，提示sBMP-2和sHBD3可改变微球微观形态。见图2a。
图2
微球理化特性表征
a. 扫描电镜观察 从左至右分别为f-PMS、p-PMS，从上至下放大倍数分别为500、1 200，红色箭头示BMP-2和HBD3；b. 药物释放曲线
Figure2. Characterizations of microspheresa. Scanning electron microscope observation From left to right for f-PMS and p-PMS, respectively; from top to bottom for the magnifications of 500 and 1 200, respectively; red arrows represented BMP-2 and HBD3; b. Drug release curve
2.1.2 吸水率检测
f-PMS吸水率为8.880%±1.922%，高于p-PMS的8.307%±2.146%，但差异无统计学意义（t=0.488，P=0.636）。
2.1.3 药物体外释放实验
f-PMS中的BMP-2和HBD3释放总趋势基本一致，均呈早期突释、后期缓释，具体表现为前2天内突释约20%，第2～10天匀速释放约30%，第10～30天缓释约28%。前10天两种药物累积释放率几乎重合，第10天后 HBD3累积释放率略高于BMP-2。见图2b。
2.2 微球抗菌能力评估
2.2.1 抗金黄色葡萄球菌实验
激光共聚焦显微镜下观察，f-PMS组金黄色葡萄球菌生长被完全抑制，微球表面几乎没有绿色活细菌，只存在大量红色死细菌；相反p-PMS组金黄色葡萄球菌生长正常，微球表面存在大量绿色活细菌。见图3a。培养12、24 h 时，f-PMS组A值分别为0.267±0.090、0.258±0.064，低于p-PMS组的2.724±0.242、3.656±0.275，差异均有统计学意义（t=29.437，P<0.001；t=23.335， P<0.001）。
图3
活/死细菌染色观察微球抗菌能力（激光共聚焦显微镜×100）
从左至右分别为活细菌、死细菌及两者重叠；从上至下分别为p-PMS、f-PMS a. 金黄色葡萄球菌；b. 大肠杆菌
Figure3. The antibacterial ability of microspheres by live/dead bacterial staining (Laser confocal microscope×100)From left to right for live bacteria, dead bacteria, and merge, respectively; from top to bottom for p-PMS and f-PMS, respectively a.
2.2.2 抗大肠杆菌实验
两组微球与大肠杆菌共培养后激光共聚焦显微镜下观察结果与金黄色葡萄球菌实验类似（图3b）。培养12、24 h时，f-PMS组A值分别为0.297±0.010、0.286±0.071，低于p-PMS组的3.200±0.450、4.320±0.804，差异均有统计学意义（t=15.426，P<0.001；t=12.244，P<0.001）。
2.3 微球生物相容性评估
培养24、48 h时，f-PMS组细胞相对增殖率分别为94.866%±11.469%、94.706%±8.195%，p-PMS组分别为100.028%±17.338%、98.615%±16.551%，组间差异均无统计学意义（t=0.608，P=0.557；t=0.619，P=0.615）。激光共聚焦显微镜下观察两组仅在48 h时发现极少量红色死细胞。见图4。
图4
活/死细胞染色观察微球生物相容性（激光共聚焦显微镜×20）
从左至右分别为活细菌、死细菌及两者重叠 a. p-PMS；b. f-PMS
Figure4. Biocompatibility of microspheres by live/dead cell staining (Laser confocal microscope×20)From left to right for live bacteria, dead bacteria, and merge, respectively a. p-PMS; b. f-PMS
2.4 微球对hBMSCs成骨分化的影响
2.4.1 COL-1免疫荧光染色检测
激光共聚焦显微镜下见两组hBMSCs成骨特异性蛋白COL-1表达均为阳性，但f-PMS组COL-1荧光强度（57.725±4.132）高于p-PMS组（2.081±1.375），差异有统计学意义（t=22.127，P<0.001）。见图5。
图5
COL-1免疫荧光染色观察（激光共聚焦显微镜×40）
从左至右分别为COL-1、细胞核、肌动蛋白及三者重叠 a. p-PMS；b. f-PMS
Figure5. COL-1 immunofluorescence staining observation（Laser confocal microscope×40）From left to right for COL-1，nucleus, actin protein, and merge, respectively a. p-PMS; b. f-PMS
2.4.2 ALP活性检测
培养5、10 d时，f-PMS组ALP活性分别为（5 851.572±953.166）、（8 294.177±2 509.040）U/g蛋白，均高于p-PMS组（2 048.396±217.479）、（2 481.611±113.610） U/g蛋白，差异有统计学意义（t=6.738，P=0.003；t=3.866，P=0.018）。
3 讨论
骨组织工程通常由支架、骨细胞（或干细胞）和生长因子组成。研究已证实以BMP-2为代表的生长因子能有效促进骨损伤部位快速修复，实现新骨组织形成[13-15]。优良的生物相容性、有效的促成骨分化作用和强抗菌性是骨组织工程支架最重要的3个条件，同时满足这3个条件的支架材料成为骨科领域的研究热点[5, 16]。
可注射微球在骨科治疗中表现出巨大应用前景，本研究利用微流控技术成功制备了f-PMS，扫描电镜结果显示f-PMS直径与p-PMS接近。p-PMS表面粗糙，均匀分布孔隙，与我们前期制备的PBVHx微球相似[9]，而加入SL介导的BMP-2和HBD3后，f-PHA微球表面变得光滑，这可能是蛋白质引入所致。体外释放实验显示f-PMS中的BMP-2和HBD3释放曲线基本吻合，均呈现早期突释、后期缓释规律，且在0～2 d约释放20%，2～10 d约释放30%。在骨科手术早期，BMP-2快速释放并保持在高水平可以有效诱导Smad信号通路的发生，从而加速矿化结节形成、促进成骨分化和骨愈合，缩短患者康复时间[17]。同时在手术早期，切口易受细菌感染，而HBD3早期突释有利于保护切口免于细菌感染，促进组织愈合。
细菌感染是骨组织工程支架植入失败的主要原因，其中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌和铜绿假单胞菌等是导致感染的主要病原体。临床上大量使用抗生素来抑制骨科手术过程中的细菌感染，这使得细菌耐药性增加，同时抗生素会抑制成骨细胞活力并减少其数量，因此研发具备强抗菌性和低毒性HBD3成为骨组织工程研究热点[8, 18]。Wang等[19]发现HBD3能在BMSCs中高度稳定表达，并赋予BMSCs强大的抗菌能力。我们对PHA微球的抗菌性进行检测，发现f-PMS能完全抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长，说明其具有优良的广谱抗菌性，作为骨组织工程支架能发挥强抑菌作用。
我们前期研究已证实PBVHx具有良好的生物相容性，是PHA家族中理想的骨组织工程支架材料来源[9]。有研究显示PHA能有效促3T3-L1前脂肪细胞成骨分化，诱导新骨形成，对治疗小鼠颅骨缺损具有积极意义，表现出良好生物相容性[6, 20]。Dhania 等[21]研究也发现制备的PHA纳米颗粒可以有效提高Vero细胞的增殖能力和黏附力，对细胞表现出良好生物相容性。为了避免微球因重力压迫细胞，我们在生物相容性实验中利用Transwell将微球和细胞隔开培养，CCK-8试剂盒检测培养24、48 h后细胞相对增殖率均达95%～98%，且f-PMS和p-PMS组间差异无统计学意义，进一步说明两种微球均有良好生物相容性，可以成为骨组织工程理想材料。
诱导BMSCs成骨分化是促进新骨形成和骨再生的潜在方案，也是评价骨组织工程支架性能的重要指标。BMSCs先分化为前成骨细胞，再经过成骨细胞、骨细胞、骨衬里细胞3个步骤完成成骨分化，分化过程受到BMP-2/4/6/7/9信号通路、Wnt信号通路和Shh信号通路等调控，其中BMP-2是在BMSCs成骨分化中研究最广泛的BMP家族成员[22]。我们利用免疫荧光技术检测了成骨分化特异性蛋白COL-1的荧光强度，结果发现f-PMS组细胞的COL-1荧光强度显著高于p-PMS组，说明f-PMS负载的BMP-2可以有效促进COL-1蛋白表达。COL-1的表达通常作为骨损伤修复的重要标志物。Liu等[8]发现成骨/抗菌双功能钛合金材料可以有效促进hBMSCs成骨分化，COL-1表达显著提高。Mao等[23]在验证功能性生物陶瓷对骨质疏松骨再生影响时也发现，负载锶离子和硅离子的生物陶瓷可以增强骨形成和矿化，COL-1表达显著增加。我们制备的f-PMS促进了细胞COL-1的表达，表明其具有优良的促成骨分化作用。为了进一步验证f-PMS的促成骨分化作用，我们在细胞培养5、10 d时分别测定了ALP活性，结果表明f-PMS组ALP活性均高于p-PMS组，这与上述研究结果类似，提示制备的f-PMS具有优良促成骨分化作用。
综上述，f-PMS具有良好的缓释性能、生物相容性以及抗菌性，同时能促进hBMSCs成骨分化，具备临床应用潜能。这些都为骨组织工程支架的构建、负载药物的选择及最终实现骨损伤修复提供了新思路。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
作者贡献声明 邬建飞：实验结果统计分析、绘图及文章撰写；王丙龙：文章撰写及审校；刘宇：文章审校；魏岱旭：实验设计及实施、数据统计、绘图及文章修改
受伤或疾病导致的骨缺损是骨科领域巨大挑战，传统治疗方式以自体骨移植为主，但存在来源有限、供区继发性损伤、慢性疼痛和感染等问题。骨组织工程技术成为骨修复理想策略[1]，但研究发现骨组织工程支架植入可能导致细菌感染、炎症、免疫排斥反应等问题，严重影响材料与骨组织融合，抑制新骨生长，因此设计同时具备促成骨分化和良好抗菌性的新型工程化材料显得尤为重要[2-4]。BMP-2是强效骨诱导生长因子，能够有效促进骨祖细胞募集、生长和矿化[5-6]。最近发现的人β防御素3（human β-defensin 3，HBD3）具有较强广谱抗菌性和低毒性，已广泛用于抗菌研究[7]。Liu等[8]研究表明BMP-2结合HBD3可以同时满足骨组织工程支架促成骨分化和抗菌性要求。
另一方面，良好的生物相容性是骨组织工程支架必不可少的属性。聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA）是一类基于合成生物学平台，由细菌合成、可生物降解的天然聚酯材料，具有良好生物相容性。同时PHA为典型疏水性材料，制备的微球对疏水性药物表现出较高的药物运载能力和稳定释放能力，有利于负载药物发挥作用[5, 9-12]。西北大学生命科学与医学部魏岱旭团队前期自创的大豆磷脂（soybean lecithin，SL）介导的生长因子修饰技术（SL-mediated introduction of growth factors into polyesters，SMIGP）[4, 6]，进一步实现了PHA对生长因子等蛋白的高效负载。迄今已有6种商用PHA（PHB、P4HB、PHBV、PHBHHx、P34HB和PBVHx）用于骨组织工程研究，其中PBVHx（又称PHBVHHx）的生物相容性最佳[9-10]。本研究拟将BMP-2和HBD3两种蛋白负载于PBVHx，再利用微流控技术制备适用于微创手术的可注射微球，以解决骨组织工程材料植入后出现的骨组织感染和成骨分化慢等难题。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
PBVHx（北京蓝晶微生物科技有限公司）；SL、BMP-2、HBD3及其ELISA试剂盒（Sigma-Aldrich公司，美国）；DMEM、FBS及青、链霉素双抗（GIBCO公司，美国）；Alexa FluorTM 555-鬼笔环肽、Ⅰ型胶原蛋白（collagen type Ⅰ，COL-1）一抗、二抗及DAPI（Thermo Fisher公司，美国）；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为本实验室保存；ALP活性试剂盒、蛋白质测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；LIVE/DEADTM BacLightTM试剂盒、LIVE/DEADTM Cell Imaging Kit试剂盒、细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8）（Invitrogen公司，美国）；OriCell® 成人BMSCs完全培养基、人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）［赛业（广州）生物科技有限公司］。
激光共聚焦显微镜（Leica公司，德国）；CO2细胞培养箱（力康生物医疗科技控股有限公司）；扫描电镜（FEI公司，捷克）；多功能酶标仪、紫外分光光度计（Thermo Scientific公司，美国）；Transwell（Corning公司，美国）。
1.2 微球制备
采用SMIGP技术制备SL-BMP-2（sBMP-2）和SL-HBD3（sHBD3）[4, 6]。将10 ng SL分别与50 ng BMP-2或30 ng HBD3溶解于含5%（V/V）醋酸的DMSO中，30℃慢磁搅拌24 h；冻干12 h除去溶剂，分别得到sBMP-2和sHBD3。将12 μg sBMP-2（约含10 μg BMP-2）、0.8 μg sHBD3（约含0.6 μg HBD3）和1 g PBVHx溶解于40 mL二氯甲烷中，形成油相（sBMP-2/sHBD3/PBVHx溶液）。将0.1 g 聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）溶于100 mL超纯水（0.1%，W/V）， 80℃慢磁搅拌2 h，形成水相（PVA溶液）。室温下，将油相和水相连接于注射器，两端连接8号不锈钢针头与微流推注泵，推进速度分别为油相0.05 mL/min、水相2 mL/min，获得含BMP-2及HBD3的功能化PHA微球（functional microsphere，f-PMS）。同法制备未添加BMP-2及HBD3的单纯PHA微球（pure microsphere，p-PMS）作为对照。f-PMS具体制备流程见图1。
图1
f-PMS制备流程和药物释放示意图
Figure1.
Schematic of preparation and drug release of f-PHA
1.3 微球观测
1.3.1 微球理化特性表征
① 微球微观形貌观测：采用扫描电镜在15 kV条件下观察两种微球表面结构及直径。
② 吸水率检测：取两种干燥微球称重记为Wd，置于纯水中24 h后取出，用滤纸吸干表面水分后称重，记为Ww。每种微球设定4个平行样品，按照以下公式计算微球吸水率：吸水率=（Ww–Wd）/Wd×100%。
③ 药物体外释放实验：取1 g f-PMS置于含40 mL PBS的50 mL离心管中，37℃、150 r/min恒温摇床处理30 d；期间分别于第0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30天收集PBS，采用ELISA检测试剂盒检测BMP-2及HBD3浓度。按照以下公式计算累积释放率：累积释放率=C1/C0×100%，其中C0表示样品中HBD3或BMP-2理论总浓度，C1为上述各时间点浓度。
1.3.2 微球抗菌能力评估
采用LB培养基制备起始细菌浊度为0.2的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬液，各取10 mL置于15 mL无菌离心管，分别加入0.5 g f-PMS和p-PMS。37℃、200 r/min恒温摇床培养12、24 h时，采用紫外分光光度计于600 nm处测量吸光度（A）值，表示细菌浊度。同时，经LIVE/DEADTM BacLightTM试剂盒染色处理后，激光共聚焦显微镜下观察细菌情况，绿色荧光为活细菌，红色荧光为死细菌。
1.3.3 微球生物相容性评估
将1×105个hBMSCs接种于Transwell底部的24孔板，分别将10 mg f-PMS和p-PMS放置于Transwell小室中，同时以未添加微球为空白组；使用OriCell®成人BMSCs完全培养基于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，隔天换液。培养24、48 h时，加入10%CCK-8后再培养2 h，使用紫外分光光度计测量405 nm处A值，按照以下公式计算细胞相对增殖率：细胞相对增殖率=实验组A值/空白组A值×100%，实验重复6次。使用LIVE/DEADTM Cell Imaging Kit试剂盒对微球表面上的细胞进行染色，并利用激光共聚焦显微镜观察细胞存活情况，活细胞呈绿色染色，死细胞呈红色染色。
1.3.4 微球对hBMSCs成骨分化的影响
将hBMSCs接种于含细胞爬片的24孔板中，每孔1×104个细胞，分别将10 mg f-PMS和p-PMS放置于Transwell小室中（以未添加微球组为空白组），使用OriCell®成人BMSCs完全培养基于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，隔天换液，并持续培养10 d。
① COL-1免疫荧光染色观察：培养后10 d取细胞经4%多聚甲醛固定、0.1% Triton X-100渗透、3% 牛血清白蛋白室温封闭；每孔加入450 μL COL-1一抗（1∶250，1%牛血清白蛋白-PBS溶液稀释），湿盒4℃过夜孵育，PBS 清洗3 次；与二抗室温孵育1 h，PBS 洗涤3 次；最后使用DAPI、Alexa FluorTM 555-鬼笔环肽染色后，滴加适量抗荧光淬灭剂封片，激光共聚焦显微镜下观察COL-1表达，并采用显微镜自带软件分析相对荧光强度。实验重复3次。
②ALP活性检测：于培养后5、10 d取hBMSCs，参照ALP活性试剂盒和蛋白质测定试剂盒操作说明书检测细胞中ALP总活性和总蛋白含量，两者比值即为单位蛋白中ALP含量。实验重复3次。
1.4 统计学方法
采用GraphPad Prism 6.0统计软件进行分析。计量资料行正态性检验，均符合正态分布，以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 微球理化特性表征
2.1.1 微球微观形貌
扫描电镜观察示p-PMS和f-PMS两种微球直径相近，分别为（108.95±8.12）μm和（106.70±9.39）μm。其中，p-PMS表面粗糙，分布着直径为1～3 μm的孔隙；而f-PMS表面更光滑，且负载大量BMP-2和HBD3白色颗粒状物质，提示sBMP-2和sHBD3可改变微球微观形态。见图2a。
图2
微球理化特性表征
a. 扫描电镜观察 从左至右分别为f-PMS、p-PMS，从上至下放大倍数分别为500、1 200，红色箭头示BMP-2和HBD3；b. 药物释放曲线
Figure2. Characterizations of microspheresa. Scanning electron microscope observation From left to right for f-PMS and p-PMS, respectively; from top to bottom for the magnifications of 500 and 1 200, respectively; red arrows represented BMP-2 and HBD3; b. Drug release curve
2.1.2 吸水率检测
f-PMS吸水率为8.880%±1.922%，高于p-PMS的8.307%±2.146%，但差异无统计学意义（t=0.488，P=0.636）。
2.1.3 药物体外释放实验
f-PMS中的BMP-2和HBD3释放总趋势基本一致，均呈早期突释、后期缓释，具体表现为前2天内突释约20%，第2～10天匀速释放约30%，第10～30天缓释约28%。前10天两种药物累积释放率几乎重合，第10天后 HBD3累积释放率略高于BMP-2。见图2b。
2.2 微球抗菌能力评估
2.2.1 抗金黄色葡萄球菌实验
激光共聚焦显微镜下观察，f-PMS组金黄色葡萄球菌生长被完全抑制，微球表面几乎没有绿色活细菌，只存在大量红色死细菌；相反p-PMS组金黄色葡萄球菌生长正常，微球表面存在大量绿色活细菌。见图3a。培养12、24 h 时，f-PMS组A值分别为0.267±0.090、0.258±0.064，低于p-PMS组的2.724±0.242、3.656±0.275，差异均有统计学意义（t=29.437，P<0.001；t=23.335， P<0.001）。
图3
活/死细菌染色观察微球抗菌能力（激光共聚焦显微镜×100）
从左至右分别为活细菌、死细菌及两者重叠；从上至下分别为p-PMS、f-PMS a. 金黄色葡萄球菌；b. 大肠杆菌
Figure3. The antibacterial ability of microspheres by live/dead bacterial staining (Laser confocal microscope×100)From left to right for live bacteria, dead bacteria, and merge, respectively; from top to bottom for p-PMS and f-PMS, respectively a.
2.2.2 抗大肠杆菌实验
两组微球与大肠杆菌共培养后激光共聚焦显微镜下观察结果与金黄色葡萄球菌实验类似（图3b）。培养12、24 h时，f-PMS组A值分别为0.297±0.010、0.286±0.071，低于p-PMS组的3.200±0.450、4.320±0.804，差异均有统计学意义（t=15.426，P<0.001；t=12.244，P<0.001）。
2.3 微球生物相容性评估
培养24、48 h时，f-PMS组细胞相对增殖率分别为94.866%±11.469%、94.706%±8.195%，p-PMS组分别为100.028%±17.338%、98.615%±16.551%，组间差异均无统计学意义（t=0.608，P=0.557；t=0.619，P=0.615）。激光共聚焦显微镜下观察两组仅在48 h时发现极少量红色死细胞。见图4。
图4
活/死细胞染色观察微球生物相容性（激光共聚焦显微镜×20）
从左至右分别为活细菌、死细菌及两者重叠 a. p-PMS；b. f-PMS
Figure4. Biocompatibility of microspheres by live/dead cell staining (Laser confocal microscope×20)From left to right for live bacteria, dead bacteria, and merge, respectively a. p-PMS; b. f-PMS
2.4 微球对hBMSCs成骨分化的影响
2.4.1 COL-1免疫荧光染色检测
激光共聚焦显微镜下见两组hBMSCs成骨特异性蛋白COL-1表达均为阳性，但f-PMS组COL-1荧光强度（57.725±4.132）高于p-PMS组（2.081±1.375），差异有统计学意义（t=22.127，P<0.001）。见图5。
图5
COL-1免疫荧光染色观察（激光共聚焦显微镜×40）
从左至右分别为COL-1、细胞核、肌动蛋白及三者重叠 a. p-PMS；b. f-PMS
Figure5. COL-1 immunofluorescence staining observation（Laser confocal microscope×40）From left to right for COL-1，nucleus, actin protein, and merge, respectively a. p-PMS; b. f-PMS
2.4.2 ALP活性检测
培养5、10 d时，f-PMS组ALP活性分别为（5 851.572±953.166）、（8 294.177±2 509.040）U/g蛋白，均高于p-PMS组（2 048.396±217.479）、（2 481.611±113.610） U/g蛋白，差异有统计学意义（t=6.738，P=0.003；t=3.866，P=0.018）。
3 讨论
骨组织工程通常由支架、骨细胞（或干细胞）和生长因子组成。研究已证实以BMP-2为代表的生长因子能有效促进骨损伤部位快速修复，实现新骨组织形成[13-15]。优良的生物相容性、有效的促成骨分化作用和强抗菌性是骨组织工程支架最重要的3个条件，同时满足这3个条件的支架材料成为骨科领域的研究热点[5, 16]。
可注射微球在骨科治疗中表现出巨大应用前景，本研究利用微流控技术成功制备了f-PMS，扫描电镜结果显示f-PMS直径与p-PMS接近。p-PMS表面粗糙，均匀分布孔隙，与我们前期制备的PBVHx微球相似[9]，而加入SL介导的BMP-2和HBD3后，f-PHA微球表面变得光滑，这可能是蛋白质引入所致。体外释放实验显示f-PMS中的BMP-2和HBD3释放曲线基本吻合，均呈现早期突释、后期缓释规律，且在0～2 d约释放20%，2～10 d约释放30%。在骨科手术早期，BMP-2快速释放并保持在高水平可以有效诱导Smad信号通路的发生，从而加速矿化结节形成、促进成骨分化和骨愈合，缩短患者康复时间[17]。同时在手术早期，切口易受细菌感染，而HBD3早期突释有利于保护切口免于细菌感染，促进组织愈合。
细菌感染是骨组织工程支架植入失败的主要原因，其中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌和铜绿假单胞菌等是导致感染的主要病原体。临床上大量使用抗生素来抑制骨科手术过程中的细菌感染，这使得细菌耐药性增加，同时抗生素会抑制成骨细胞活力并减少其数量，因此研发具备强抗菌性和低毒性HBD3成为骨组织工程研究热点[8, 18]。Wang等[19]发现HBD3能在BMSCs中高度稳定表达，并赋予BMSCs强大的抗菌能力。我们对PHA微球的抗菌性进行检测，发现f-PMS能完全抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长，说明其具有优良的广谱抗菌性，作为骨组织工程支架能发挥强抑菌作用。
我们前期研究已证实PBVHx具有良好的生物相容性，是PHA家族中理想的骨组织工程支架材料来源[9]。有研究显示PHA能有效促3T3-L1前脂肪细胞成骨分化，诱导新骨形成，对治疗小鼠颅骨缺损具有积极意义，表现出良好生物相容性[6, 20]。Dhania 等[21]研究也发现制备的PHA纳米颗粒可以有效提高Vero细胞的增殖能力和黏附力，对细胞表现出良好生物相容性。为了避免微球因重力压迫细胞，我们在生物相容性实验中利用Transwell将微球和细胞隔开培养，CCK-8试剂盒检测培养24、48 h后细胞相对增殖率均达95%～98%，且f-PMS和p-PMS组间差异无统计学意义，进一步说明两种微球均有良好生物相容性，可以成为骨组织工程理想材料。
诱导BMSCs成骨分化是促进新骨形成和骨再生的潜在方案，也是评价骨组织工程支架性能的重要指标。BMSCs先分化为前成骨细胞，再经过成骨细胞、骨细胞、骨衬里细胞3个步骤完成成骨分化，分化过程受到BMP-2/4/6/7/9信号通路、Wnt信号通路和Shh信号通路等调控，其中BMP-2是在BMSCs成骨分化中研究最广泛的BMP家族成员[22]。我们利用免疫荧光技术检测了成骨分化特异性蛋白COL-1的荧光强度，结果发现f-PMS组细胞的COL-1荧光强度显著高于p-PMS组，说明f-PMS负载的BMP-2可以有效促进COL-1蛋白表达。COL-1的表达通常作为骨损伤修复的重要标志物。Liu等[8]发现成骨/抗菌双功能钛合金材料可以有效促进hBMSCs成骨分化，COL-1表达显著提高。Mao等[23]在验证功能性生物陶瓷对骨质疏松骨再生影响时也发现，负载锶离子和硅离子的生物陶瓷可以增强骨形成和矿化，COL-1表达显著增加。我们制备的f-PMS促进了细胞COL-1的表达，表明其具有优良的促成骨分化作用。为了进一步验证f-PMS的促成骨分化作用，我们在细胞培养5、10 d时分别测定了ALP活性，结果表明f-PMS组ALP活性均高于p-PMS组，这与上述研究结果类似，提示制备的f-PMS具有优良促成骨分化作用。
综上述，f-PMS具有良好的缓释性能、生物相容性以及抗菌性，同时能促进hBMSCs成骨分化，具备临床应用潜能。这些都为骨组织工程支架的构建、负载药物的选择及最终实现骨损伤修复提供了新思路。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
作者贡献声明 邬建飞：实验结果统计分析、绘图及文章撰写；王丙龙：文章撰写及审校；刘宇：文章审校；魏岱旭：实验设计及实施、数据统计、绘图及文章修改
