引用本文： 黄孟全, 樊简, 马子扬, 李靖, 鲁亚杰. 预血管化多孔β-磷酸三钙组织工程骨的构建及其生物学效应评价. 中国修复重建外科杂志, 2022, 36(5): 625-632. doi: 10.7507/1002-1892.202202010 复制
近年来，组织工程技术的发展为骨缺损修复提供了新方向[1-3]， 然而组织工程支架植入后血管化不足成为影响其广泛用于骨缺损修复的主要原因。研究表明，组织工程骨植入后距离宿主毛细血管200 µm以上的区域血管再生匮乏，支架内部易形成“空心”区域，存在营养支持缺乏和代谢产物堆积的问题，直接影响修复效果[4]。构建预血管化组织工程支架，使其植入体内后能迅速与宿主血管对接，是解决组织工程骨存活、提高骨修复能力的有效途径[5]。基于血管种子细胞和成骨种子细胞构建预血管化组织工程骨，有望打破支架内部血管化匮乏状态，促进组织修复进程[6-7]。但目前关于预血管化组织工程骨植入体内后血管转归，以及早期血管化进程的定量评估研究报道较少。
本研究拟采用内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）联合BMSCs与多孔β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）生物陶瓷支架直接接触共培养的方法，构建预血管化组织工程骨，然后将其植入兔股骨髁缺损模型，采用本课题组前期建立的“骨内微血管可视化研究模型”技术[8-9]对生物陶瓷支架的血管化生物效应进行定量评估，以期为解决组织工程骨内部血管化不足的难题奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物与主要试剂、仪器
4月龄新西兰大白兔12只，体质量2.0～2.5 kg，雌雄不限，由空军军医大学实验动物中心提供。多孔β-TCP生物陶瓷支架（上海贝奥路生物材料有限公司），支架呈圆柱体，直径6 mm、高12 mm，孔隙率70%±15%，大孔直径400～500 μm，连通孔直径120～160 μm。
兔外周血淋巴细胞分离液（北京索莱宝科技有限公司）；DMEM培养基、FBS（GIBCO公司，美国）、EGM-2MV培养基（Lonza公司，瑞士）；CD11b-PE、CD45-FITC、CD34-FITC、CD90-FITC、CD29-FITC（Sigma公司，德国）；CD133、VEGF受体 2（VEGF receptor 2，VEGFR-2）、CD34（北京博奥森生物技术有限公司）；荧光染色剂Dil-Ac-LDL、FITC-UEA-Ⅰ（上海懋康生物科技有限公司）；BMSCs成骨、成脂诱导培养基（苏州赛业生物科技有限公司）；Matrigel基质胶（BD公司，美国）。
倒置相差显微镜、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜（Zeiss公司，德国）；流式细胞仪（Beckman Coulter公司，美国）；扫描电镜（日立公司，日本）；Micro-CT（Bruker公司，德国）。
1.2 细胞培养及鉴定
1.2.1 细胞分离及培养
取12只兔经耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉后，用骨髓穿刺针于髂后上棘穿刺，每只抽取骨髓液3～5 mL。等量PBS稀释，将稀释的骨髓液按照1∶1比例加至兔淋巴细胞分离液上层，以离心半径15 cm、2 000 r/min 离心30 min。吸取单个核细胞层，加入含10%FBS、1%青霉素/链霉素的DMEM培养基，置于37℃、 5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。培养48 h后贴壁细胞为BMSCs，收集BMSCs以DMEM培养基继续培养。另外收集未贴壁细胞，更换为含4%FBS、1%青霉素/链霉素的EGM-2MV培养基培养，用于扩增EPCs。待BMSCs、EPCs生长融合至70%～80%时，按照1∶3比例传代，取第3代细胞用于后续实验。
1.2.2 细胞鉴定
① 取第3代细胞，采用流式细胞仪检测表面分子标志物，其中BMSCs表面分子标志物包括CD29、CD90、CD34、CD45、CD11b；EPCs包括CD34、CD133、VEGFR-2。② BMSCs分别行成骨、成脂诱导培养4、3周后，对应行茜素红和油红O染色，观察细胞成骨和成脂分化能力。③ EPCs行Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ双荧光染色，荧光显微镜下观察红色为Dil-Ac-LDL阳性染色，绿色为FITC-UEA-Ⅰ阳性染色，黄色为Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ双阳性染色，计算双阳性染色细胞比例，观察细胞吞噬功能。
1.3 EPCs/BMSCs共培养对EPCs成管能力的影响
将Matrigel基质胶置于4℃冰箱过夜溶解后，加入预冷的48孔板（100 μL/孔），37℃孵育1 h使基质胶凝固。0.25%胰蛋白酶消化EPCs和BMSCs，制备细胞悬液；EPCs/BMSCs组将两种细胞以2∶1比例接种于48孔板（EPCs为4×104个/孔、BMSCs为2×104个/孔）共培养，加入以1∶1 比例混合的DMEM、EGM-2MV培养基；EPCs组将EPCs以4×104个/孔接种于48孔板，采用EGM-2MV培养基培养，作为对照；每组重复3孔。于3、6、9 h倒置相差显微镜下观察EPCs成管效应；3 h为血管形成上升期、9 h为消退期，故本研究选择6 h随机取3个视野拍照，采用Image-Pro Plus 6.0软件（Media Cybernetics公司，美国）计数管型样结构、分支以及测量成管总长度。
1.4 预血管化组织工程骨构建及生物学评估
将多孔β-TCP生物陶瓷支架浸没于DMEM培养基中2 h，备用。将EPCs/BMSCs（EPCs 1×106 个，BMSCs 5×105个）接种于多孔β-TCP生物陶瓷支架（EPCs/BMSCs组），同上法选择对应培养基共培养，制备预血管化组织工程骨。7 d后取出置于多聚甲醛固定，扫描电镜观察细胞黏附状态；经FITC-CD31标记EPCs和鬼笔环肽染色细胞骨架，激光共聚焦显微镜下观察细胞在支架上的黏附、增殖和成管情况。以EPCs（1×106个）接种于多孔β-TCP生物陶瓷支架（EPCs 组）作为对照。
1.5 预血管化组织工程骨植入体内早期血管化观测
1.5.1 兔股骨髁缺损模型建立及分组
将12只新西兰大白兔随机分为实验组及对照组，每组6只。实验组参照1.4方法制备自体来源的预血管化组织工程骨。两组动物同上法麻醉后，于右后肢作股骨外侧纵切口，暴露股骨髁，采用高速磨钻制备直径6 mm、深12 mm骨缺损，分别植入多孔β-TCP生物陶瓷支架（对照组）及预血管化组织工程骨（实验组）修复。术后连续 3 d注射青霉素预防感染，不限制动物活动，正常饮食、水。见图1。
图1
动物模型制备
a. 骨缺损模型；b. 骨缺损修复模型
Figure1. Schematic diagram of animal model preparationa. Bone defect model; b. Bone defect repair model
1.5.2 支架内新生血管可视化研究
采用“骨内微血管可视化研究模型”技术[8-9]对植入支架的新生血管进行量化评估。术后4、8周两组分别取3只动物，同上法麻醉后作腹部正中切口，显露腹主动、静脉，结扎上述血管近心端，经腹主动脉远心端依次灌注肝素生理盐水（100 U/L）1 000 mL、10%中性甲醛固定液300 mL、MicrofillMV-117灌注液50 mL，对下肢血管进行清洗、固定和灌注。然后，经耳缘静脉注射过量3%戊巴比妥钠（>100 mg/kg）处死动物，置于4℃冰箱中过夜。取术侧股骨下段标本，置于10%中性甲醛固定72 h后，14%EDTA 脱钙液脱钙。采用Micro-CT对血管进行扫描和三维重建，数据导入Image-Pro Plus 6.0软件，测算血管数量、血管直径和面积分数。将扫描后的标本硬组织包埋，制备厚度为300 μm的切片，抛光后采用荧光背景下血管成像方法（激发光为蓝色光，波长430～460 nm）观察支架中新生血管分布及形态。荧光背景下骨及纤维组织为绿色、血管为红色。
1.6 统计学方法
采用SPSS22.0统计软件进行分析。计量资料行方差齐性检验和正态性检验，满足方差齐性且呈正态分布时，数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 细胞培养及鉴定
流式细胞仪检测示第3代BMSCs高表达CD29、CD90，低表达CD34、CD11b、CD45；第3代EPCs高表达CD133、VEGFR-2、CD34。见图2。BMSCs成骨诱导培养4周，茜素红染色见散在的红色结节，提示局部钙盐沉积，钙结节形成；成脂诱导培养3周，光镜下可见部分细胞内有少量小脂滴形成，成串珠样排列，个别细胞内脂滴较大，油红O染色后脂滴呈红色。见图3。EPCs经Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ双荧光染色后，荧光显微镜下可见双阳性染色细胞，阳性率为96.3%±1.5%。见图4。
图2
流式细胞仪检测
a. BMSCs；b. EPCs
Figure2. Flow cytometry detectiona. BMSCs; b. EPCs
图3
BMSCs功能鉴定（×40）
a. 成骨诱导后茜素红染色；b. 成脂诱导后油红O染色
Figure3. BMSCs functional identification (×40)a. Alizarin red staining after osteogenic induction; b. Oil red O staining after lipogenesis induction
图4
EPCs功能鉴定(荧光显微镜×40)
a. Dil-Ac-LDL染色；b. FITC-UEA-Ⅰ染色；c. 二者重叠
Figure4. EPCs functional identification (Fluorescence microscope×40)a. Dil-Ac-LDL staining; b. FITC-UEA-Ⅰ staining; c. Merge
2.2 EPCs/BMSCs共培养对EPCs成管能力的影响
培养3 h，两组可见部分细胞变形拉长向周围延伸，细胞间相互连接并形成少量管型样结构。培养6 h，与EPCs组相比， EPCs/BMSCs组形成了更为广泛的管型样结构，且在EPCs形成的管型样结构周围有大量BMSCs。EPCs/BMSCs组及EPCs组形成的管型样结构分别为（59.4±13.3）、（47.0±8.3）个，分支为（122.0±11.9）、（107.7±16.7）个，成管总长度为（11.1±1.1）、（10.2±0.7）cm，组间差异均有统计学意义（t=−2.704，P=0.014；t=−2.201，P=0.040；t=−2.317，P=0.031）。培养9 h，两组均可见部分细胞聚集成团，管型样结构减少，上述现象EPCs组更明显。见图5。
图5
各组成管实验观察（倒置相差显微镜×40）
从左至右依次为培养3、6、9 h a. EPCs组；b. EPCs/BMSCs组
Figure5. Observation of lumen formation in each group (Inverted phase contrast microscope×40)From left to right for 3, 6, and 9 hours, respectivelya. EPCs group; b. EPCs/BMSCs group
2.3 预血管化组织工程骨生物学评估
2.3.1 扫描电镜观察
支架表面：EPCs组细胞贴附于支架表面，呈膜片结构，与支架结合欠佳，支架部分区域无细胞覆盖；EPCs/BMSCs组细胞紧紧贴附于支架表面，细胞更密集，细胞形成的膜片更厚，呈双层结构，下层为EPCs细胞膜片，上层BMSCs伸出伪足贴附于EPCs细胞膜片上。
支架内部：EPCs组支架内部细胞较表面明显减少，细胞贴孔内壁生长，穿过内连接进入另一孔隙，内连接处细胞与孔内贴壁细胞可形成管型样结构。EPCs/BMSCs组孔内贴壁细胞明显较多，多集中在内连接处周围，孔与孔之间细胞连接较好，可见柱状管型样结构且长于EPCs组。见图6。
图6
细胞与支架共培养 7 d 扫描电镜观察（×500）
左：支架表面 右：支架内部 a. EPCs组；b. EPCs/BMSCs组
Figure6. Scanning electron microscopy observation of cells and scaffolds after 7 days of co-culture (×500)Left: Surface of scaffold Right: Interior of scaffold a. EPCs group; b. EPCs/BMSCs group
2.3.2 激光共聚焦显微镜观察
EPCs/BMSCs组两种细胞交织排列并在孔内贴壁生长，细胞更密集，形成膜片明显厚于EPCs组，可见管型样结构形成。见图7。
图7
细胞与支架共培养7 d激光共聚焦显微镜观察（×100）
从左至右为CD31染色、鬼笔环肽染色、二者重叠 a. EPCs组；b. EPCs/BMSCs组
Figure7. Laser scanning confocal microscopy observation of cells and scaffolds at 7 days of co-culture (×100)From left to right for CD31 staining, phalloidin staining, and merge, respectively a. EPCs group; b. EPCs/BMSCs group
2.4 预血管化组织工程骨植入体内早期血管化
2.4.1 Micro-CT观测
术后4、8周标本脱钙后，Micro-CT扫描可以清晰显示支架内部血管网络。术后4周，两组标本均可见支架残影，实验组支架边缘新生血管较多，血管数量从支架边缘向中心逐渐减少；对照组仅在支架边缘见散在分布的新生血管，近中心处无血管形成。 术后8周，两组支架内部均有大量血管形成，仅对照组可见少量支架残影。见图8。 除术后4周两组面积分数差异无统计学意义（P>0.05）外，其余各时间点实验组血管数量、血管直径以及面积分数均优于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
图8
两组Micro-CT观察血管形成情况
左：对照组 右：实验组 a. 术后4周；b. 术后8周
Figure8. Micro-CT observation of neovascularization in both groupsLeft: Control group Right: Experimental group a. Four weeks after implantation; b. Eight weeks after implantation
表1
两组血管可视化研究相关指标比较（n=3，
）
Table1.
Comparison of related indicators of vascular visualization between the two groups (n=3, 
)
2.4.2 荧光背景成像观察
术后4周，两组均可见新生血管由骨皮质内的次级血管进入支架后形成分支，向不同方向延伸。实验组支架周边新生血管较多，部分新生血管长入支架内部深度可达5～6个大孔；对照组新生血管仅在支架边缘，数量较少。8周时，两组新生血管均已贯穿支架内部，实验组血管更密、管径更大，血管分支数较多，趋向成熟。见图9。
图9
荧光显微镜下观察两组新生血管情况
左：对照组 右：实验组 a. 术后4周（×10）；b. 术后8周（×10）；c. 术后8周局部放大（×40）
Figure9. Fluorescence microscope observation of neovascularization in both groupsLeft: Control group Right: Experimental group a. Four weeks after implantation (×10); b. Eight weeks after implantation (×10); c. Local magnification of the image at 8 weeks after implantation (×40)
3 讨论
血管化在骨愈合和修复过程中起着重要作用，新生血管可以将成骨前体细胞、相关信号分子、营养物质携带至局部微环境中，并清除代谢产物，从而为骨再生修复提供一种有利的生理代谢微环境[10]。既往研究表明，组织工程骨的血管化程度与新生骨组织数量和质量成正相关，血管生成细胞与成骨细胞通过复杂的内在分子机制相互作用，共同调节微血管稳态以及成骨-破骨之间的平衡[11]。因此，构建高效的组织工程骨，必须同时兼顾血管化和成骨两者因素[12]。
目前，组织工程骨血管化策略主要有利用生长因子促进血管生成、添加血管生成相关细胞、显微外科技术移植血管、支架预血管化等。在上述方法中，基于血管种子细胞和成骨细胞共培养构建预血管化组织工程骨越来越受重视[13-14]。BMSCs因具有多向分化性能，已被作为种子细胞广泛应用于构建组织工程骨，但仍未克服支架内部血管化不良的缺陷[15]。既往研究多将人脐带静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）作为血管种子细胞，加快骨修复血管化进程，但HUVECs分化能力有限，且临床实际应用中其来源受到极大限制[16-17]。EPCs是内皮细胞的前体细胞，可分化为成熟血管内皮细胞而生成血管，是组织工程支架血管化最具有潜力的种子细胞之一[18]。研究表明，可利用BMSCs和EPCs共培养的协同效应提高组织工程骨血管生成和骨修复能力[19]。Liang等[20]研究发现，BMSCs和EPCs在体外共培养后，血管生成相关基因和成骨相关基因表达水平显著升高，复合支架植入体内后可见更多的新生血管和新生骨组织。也有研究证实，BMSCs的存在有利于EPCs在组织工程支架上的微血管网络生成，且BMSCs也可以作为血管周细胞维持新生血管功能的稳定性[21]。因此，本研究选择自体EPCs和BMSCs进行直接接触共培养，体外构建预血管化组织工程骨。体外实验结果显示BMSCs的存在显著提升了 EPCs成管能力，二者协同作用，促进了种子细胞在骨修复支架的黏附和功能发挥，表明EPCs/BMSCs共培养体系有助于体外预血管化组织工程骨的构建。体内实验结果显示预血管化组织工程骨的血管参数评估明显优于对照组，植入8周后支架内部已基本完成整体血管化，提示预血管化组织工程骨植入体内后可以缩短新生血管网络形成时间，提高支架内部血管化进程。这对于骨修复支架，尤其是大块组织工程骨支架的活化和骨组织再生具有重要意义。Kawecki等[22]采用预血管化类骨组织修复大鼠颅骨缺损，结果显示该方法显著提高了移植骨的存活率和骨缺损修复效果。
组织工程骨支架内部血管化的精确定量评估一直是骨组织工程研究难点之一。既往研究采用免疫荧光/免疫组织化学染色技术对血管进行标记，但无法对血管全貌以及功能形态进行评价[23]。本课题组前期研究提出了基于Microfill血管灌注、Micro-CT扫描重建以及荧光背景下血管成像的“骨内微血管可视化研究模型” 构建技术[8-9]。基于该方法，本次研究体内实验对构建的预血管化组织工程骨内微血管形成参数进行了定量评估，进一步表明了BMSCs/EPCs共培养对骨修复支架血管化进程具有显著促进作用。有研究指出，EPCs可在体外形成预构型血管网络，植入体内后可迅速与宿主血管形成对接，直接改善支架内部的血管参数，也可通过释放血管生成因子招募宿主EPCs形成新生血管，间接改善支架内部的血管参数[24]。值得注意的是，本研究所采取的BMSCs和EPCs均来源于自体骨髓，应用于人体时不存在伦理问题，且操作简便，具有很好的临床转化潜能。
本研究存在如下局限性：① 研究关注于骨修复血管化进程，旨在评估 EPCs/BMSCs共培养构建的预血管化组织工程骨植入动物体内后内部血运恢复效果。由于研究采取的荧光背景下血管成像技术涉及到骨脱钙过程，因此未对骨组织进行定量评估。② 本研究尚未阐明EPCs/BMSCs促进血管化进程的具体分子机制，有待进一步深入研究。
综上述，EPCs/BMSCs共培养可促进种子细胞的黏附、增殖和成管等生物学行为，利用二者构建的预血管化组织工程骨在植入体内后能促进骨修复血管化进程。该方法为骨缺损尤其是大段骨缺损的修复重建提供了新思路。
利益冲突 在课题研究及文章撰写过程中不存在利益冲突；基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计学分析及其报道
伦理声明 研究方案经中国人民解放军空军军医大学第一附属医院伦理委员会批准（KY20193269-1）；实验动物使用许可证号：SYXK（陕）2019-001
作者贡献声明 黄孟全：研究设计、实施及文章撰写；樊简、马子扬：参与研究实施及数据收集；鲁亚杰、李靖：研究设计、评估以及文章审阅
近年来，组织工程技术的发展为骨缺损修复提供了新方向[1-3]， 然而组织工程支架植入后血管化不足成为影响其广泛用于骨缺损修复的主要原因。研究表明，组织工程骨植入后距离宿主毛细血管200 µm以上的区域血管再生匮乏，支架内部易形成“空心”区域，存在营养支持缺乏和代谢产物堆积的问题，直接影响修复效果[4]。构建预血管化组织工程支架，使其植入体内后能迅速与宿主血管对接，是解决组织工程骨存活、提高骨修复能力的有效途径[5]。基于血管种子细胞和成骨种子细胞构建预血管化组织工程骨，有望打破支架内部血管化匮乏状态，促进组织修复进程[6-7]。但目前关于预血管化组织工程骨植入体内后血管转归，以及早期血管化进程的定量评估研究报道较少。
本研究拟采用内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）联合BMSCs与多孔β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）生物陶瓷支架直接接触共培养的方法，构建预血管化组织工程骨，然后将其植入兔股骨髁缺损模型，采用本课题组前期建立的“骨内微血管可视化研究模型”技术[8-9]对生物陶瓷支架的血管化生物效应进行定量评估，以期为解决组织工程骨内部血管化不足的难题奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物与主要试剂、仪器
4月龄新西兰大白兔12只，体质量2.0～2.5 kg，雌雄不限，由空军军医大学实验动物中心提供。多孔β-TCP生物陶瓷支架（上海贝奥路生物材料有限公司），支架呈圆柱体，直径6 mm、高12 mm，孔隙率70%±15%，大孔直径400～500 μm，连通孔直径120～160 μm。
兔外周血淋巴细胞分离液（北京索莱宝科技有限公司）；DMEM培养基、FBS（GIBCO公司，美国）、EGM-2MV培养基（Lonza公司，瑞士）；CD11b-PE、CD45-FITC、CD34-FITC、CD90-FITC、CD29-FITC（Sigma公司，德国）；CD133、VEGF受体 2（VEGF receptor 2，VEGFR-2）、CD34（北京博奥森生物技术有限公司）；荧光染色剂Dil-Ac-LDL、FITC-UEA-Ⅰ（上海懋康生物科技有限公司）；BMSCs成骨、成脂诱导培养基（苏州赛业生物科技有限公司）；Matrigel基质胶（BD公司，美国）。
倒置相差显微镜、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜（Zeiss公司，德国）；流式细胞仪（Beckman Coulter公司，美国）；扫描电镜（日立公司，日本）；Micro-CT（Bruker公司，德国）。
1.2 细胞培养及鉴定
1.2.1 细胞分离及培养
取12只兔经耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉后，用骨髓穿刺针于髂后上棘穿刺，每只抽取骨髓液3～5 mL。等量PBS稀释，将稀释的骨髓液按照1∶1比例加至兔淋巴细胞分离液上层，以离心半径15 cm、2 000 r/min 离心30 min。吸取单个核细胞层，加入含10%FBS、1%青霉素/链霉素的DMEM培养基，置于37℃、 5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。培养48 h后贴壁细胞为BMSCs，收集BMSCs以DMEM培养基继续培养。另外收集未贴壁细胞，更换为含4%FBS、1%青霉素/链霉素的EGM-2MV培养基培养，用于扩增EPCs。待BMSCs、EPCs生长融合至70%～80%时，按照1∶3比例传代，取第3代细胞用于后续实验。
1.2.2 细胞鉴定
① 取第3代细胞，采用流式细胞仪检测表面分子标志物，其中BMSCs表面分子标志物包括CD29、CD90、CD34、CD45、CD11b；EPCs包括CD34、CD133、VEGFR-2。② BMSCs分别行成骨、成脂诱导培养4、3周后，对应行茜素红和油红O染色，观察细胞成骨和成脂分化能力。③ EPCs行Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ双荧光染色，荧光显微镜下观察红色为Dil-Ac-LDL阳性染色，绿色为FITC-UEA-Ⅰ阳性染色，黄色为Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ双阳性染色，计算双阳性染色细胞比例，观察细胞吞噬功能。
1.3 EPCs/BMSCs共培养对EPCs成管能力的影响
将Matrigel基质胶置于4℃冰箱过夜溶解后，加入预冷的48孔板（100 μL/孔），37℃孵育1 h使基质胶凝固。0.25%胰蛋白酶消化EPCs和BMSCs，制备细胞悬液；EPCs/BMSCs组将两种细胞以2∶1比例接种于48孔板（EPCs为4×104个/孔、BMSCs为2×104个/孔）共培养，加入以1∶1 比例混合的DMEM、EGM-2MV培养基；EPCs组将EPCs以4×104个/孔接种于48孔板，采用EGM-2MV培养基培养，作为对照；每组重复3孔。于3、6、9 h倒置相差显微镜下观察EPCs成管效应；3 h为血管形成上升期、9 h为消退期，故本研究选择6 h随机取3个视野拍照，采用Image-Pro Plus 6.0软件（Media Cybernetics公司，美国）计数管型样结构、分支以及测量成管总长度。
1.4 预血管化组织工程骨构建及生物学评估
将多孔β-TCP生物陶瓷支架浸没于DMEM培养基中2 h，备用。将EPCs/BMSCs（EPCs 1×106 个，BMSCs 5×105个）接种于多孔β-TCP生物陶瓷支架（EPCs/BMSCs组），同上法选择对应培养基共培养，制备预血管化组织工程骨。7 d后取出置于多聚甲醛固定，扫描电镜观察细胞黏附状态；经FITC-CD31标记EPCs和鬼笔环肽染色细胞骨架，激光共聚焦显微镜下观察细胞在支架上的黏附、增殖和成管情况。以EPCs（1×106个）接种于多孔β-TCP生物陶瓷支架（EPCs 组）作为对照。
1.5 预血管化组织工程骨植入体内早期血管化观测
1.5.1 兔股骨髁缺损模型建立及分组
将12只新西兰大白兔随机分为实验组及对照组，每组6只。实验组参照1.4方法制备自体来源的预血管化组织工程骨。两组动物同上法麻醉后，于右后肢作股骨外侧纵切口，暴露股骨髁，采用高速磨钻制备直径6 mm、深12 mm骨缺损，分别植入多孔β-TCP生物陶瓷支架（对照组）及预血管化组织工程骨（实验组）修复。术后连续 3 d注射青霉素预防感染，不限制动物活动，正常饮食、水。见图1。
图1
动物模型制备
a. 骨缺损模型；b. 骨缺损修复模型
Figure1. Schematic diagram of animal model preparationa. Bone defect model; b. Bone defect repair model
1.5.2 支架内新生血管可视化研究
采用“骨内微血管可视化研究模型”技术[8-9]对植入支架的新生血管进行量化评估。术后4、8周两组分别取3只动物，同上法麻醉后作腹部正中切口，显露腹主动、静脉，结扎上述血管近心端，经腹主动脉远心端依次灌注肝素生理盐水（100 U/L）1 000 mL、10%中性甲醛固定液300 mL、MicrofillMV-117灌注液50 mL，对下肢血管进行清洗、固定和灌注。然后，经耳缘静脉注射过量3%戊巴比妥钠（>100 mg/kg）处死动物，置于4℃冰箱中过夜。取术侧股骨下段标本，置于10%中性甲醛固定72 h后，14%EDTA 脱钙液脱钙。采用Micro-CT对血管进行扫描和三维重建，数据导入Image-Pro Plus 6.0软件，测算血管数量、血管直径和面积分数。将扫描后的标本硬组织包埋，制备厚度为300 μm的切片，抛光后采用荧光背景下血管成像方法（激发光为蓝色光，波长430～460 nm）观察支架中新生血管分布及形态。荧光背景下骨及纤维组织为绿色、血管为红色。
1.6 统计学方法
采用SPSS22.0统计软件进行分析。计量资料行方差齐性检验和正态性检验，满足方差齐性且呈正态分布时，数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 细胞培养及鉴定
流式细胞仪检测示第3代BMSCs高表达CD29、CD90，低表达CD34、CD11b、CD45；第3代EPCs高表达CD133、VEGFR-2、CD34。见图2。BMSCs成骨诱导培养4周，茜素红染色见散在的红色结节，提示局部钙盐沉积，钙结节形成；成脂诱导培养3周，光镜下可见部分细胞内有少量小脂滴形成，成串珠样排列，个别细胞内脂滴较大，油红O染色后脂滴呈红色。见图3。EPCs经Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ双荧光染色后，荧光显微镜下可见双阳性染色细胞，阳性率为96.3%±1.5%。见图4。
图2
流式细胞仪检测
a. BMSCs；b. EPCs
Figure2. Flow cytometry detectiona. BMSCs; b. EPCs
图3
BMSCs功能鉴定（×40）
a. 成骨诱导后茜素红染色；b. 成脂诱导后油红O染色
Figure3. BMSCs functional identification (×40)a. Alizarin red staining after osteogenic induction; b. Oil red O staining after lipogenesis induction
图4
EPCs功能鉴定(荧光显微镜×40)
a. Dil-Ac-LDL染色；b. FITC-UEA-Ⅰ染色；c. 二者重叠
Figure4. EPCs functional identification (Fluorescence microscope×40)a. Dil-Ac-LDL staining; b. FITC-UEA-Ⅰ staining; c. Merge
2.2 EPCs/BMSCs共培养对EPCs成管能力的影响
培养3 h，两组可见部分细胞变形拉长向周围延伸，细胞间相互连接并形成少量管型样结构。培养6 h，与EPCs组相比， EPCs/BMSCs组形成了更为广泛的管型样结构，且在EPCs形成的管型样结构周围有大量BMSCs。EPCs/BMSCs组及EPCs组形成的管型样结构分别为（59.4±13.3）、（47.0±8.3）个，分支为（122.0±11.9）、（107.7±16.7）个，成管总长度为（11.1±1.1）、（10.2±0.7）cm，组间差异均有统计学意义（t=−2.704，P=0.014；t=−2.201，P=0.040；t=−2.317，P=0.031）。培养9 h，两组均可见部分细胞聚集成团，管型样结构减少，上述现象EPCs组更明显。见图5。
图5
各组成管实验观察（倒置相差显微镜×40）
从左至右依次为培养3、6、9 h a. EPCs组；b. EPCs/BMSCs组
Figure5. Observation of lumen formation in each group (Inverted phase contrast microscope×40)From left to right for 3, 6, and 9 hours, respectivelya. EPCs group; b. EPCs/BMSCs group
2.3 预血管化组织工程骨生物学评估
2.3.1 扫描电镜观察
支架表面：EPCs组细胞贴附于支架表面，呈膜片结构，与支架结合欠佳，支架部分区域无细胞覆盖；EPCs/BMSCs组细胞紧紧贴附于支架表面，细胞更密集，细胞形成的膜片更厚，呈双层结构，下层为EPCs细胞膜片，上层BMSCs伸出伪足贴附于EPCs细胞膜片上。
支架内部：EPCs组支架内部细胞较表面明显减少，细胞贴孔内壁生长，穿过内连接进入另一孔隙，内连接处细胞与孔内贴壁细胞可形成管型样结构。EPCs/BMSCs组孔内贴壁细胞明显较多，多集中在内连接处周围，孔与孔之间细胞连接较好，可见柱状管型样结构且长于EPCs组。见图6。
图6
细胞与支架共培养 7 d 扫描电镜观察（×500）
左：支架表面 右：支架内部 a. EPCs组；b. EPCs/BMSCs组
Figure6. Scanning electron microscopy observation of cells and scaffolds after 7 days of co-culture (×500)Left: Surface of scaffold Right: Interior of scaffold a. EPCs group; b. EPCs/BMSCs group
2.3.2 激光共聚焦显微镜观察
EPCs/BMSCs组两种细胞交织排列并在孔内贴壁生长，细胞更密集，形成膜片明显厚于EPCs组，可见管型样结构形成。见图7。
图7
细胞与支架共培养7 d激光共聚焦显微镜观察（×100）
从左至右为CD31染色、鬼笔环肽染色、二者重叠 a. EPCs组；b. EPCs/BMSCs组
Figure7. Laser scanning confocal microscopy observation of cells and scaffolds at 7 days of co-culture (×100)From left to right for CD31 staining, phalloidin staining, and merge, respectively a. EPCs group; b. EPCs/BMSCs group
2.4 预血管化组织工程骨植入体内早期血管化
2.4.1 Micro-CT观测
术后4、8周标本脱钙后，Micro-CT扫描可以清晰显示支架内部血管网络。术后4周，两组标本均可见支架残影，实验组支架边缘新生血管较多，血管数量从支架边缘向中心逐渐减少；对照组仅在支架边缘见散在分布的新生血管，近中心处无血管形成。 术后8周，两组支架内部均有大量血管形成，仅对照组可见少量支架残影。见图8。 除术后4周两组面积分数差异无统计学意义（P>0.05）外，其余各时间点实验组血管数量、血管直径以及面积分数均优于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
图8
两组Micro-CT观察血管形成情况
左：对照组 右：实验组 a. 术后4周；b. 术后8周
Figure8. Micro-CT observation of neovascularization in both groupsLeft: Control group Right: Experimental group a. Four weeks after implantation; b. Eight weeks after implantation
表1
两组血管可视化研究相关指标比较（n=3，）
Table1.
Comparison of related indicators of vascular visualization between the two groups (n=3, )
2.4.2 荧光背景成像观察
术后4周，两组均可见新生血管由骨皮质内的次级血管进入支架后形成分支，向不同方向延伸。实验组支架周边新生血管较多，部分新生血管长入支架内部深度可达5～6个大孔；对照组新生血管仅在支架边缘，数量较少。8周时，两组新生血管均已贯穿支架内部，实验组血管更密、管径更大，血管分支数较多，趋向成熟。见图9。
图9
荧光显微镜下观察两组新生血管情况
左：对照组 右：实验组 a. 术后4周（×10）；b. 术后8周（×10）；c. 术后8周局部放大（×40）
Figure9. Fluorescence microscope observation of neovascularization in both groupsLeft: Control group Right: Experimental group a. Four weeks after implantation (×10); b. Eight weeks after implantation (×10); c. Local magnification of the image at 8 weeks after implantation (×40)
3 讨论
血管化在骨愈合和修复过程中起着重要作用，新生血管可以将成骨前体细胞、相关信号分子、营养物质携带至局部微环境中，并清除代谢产物，从而为骨再生修复提供一种有利的生理代谢微环境[10]。既往研究表明，组织工程骨的血管化程度与新生骨组织数量和质量成正相关，血管生成细胞与成骨细胞通过复杂的内在分子机制相互作用，共同调节微血管稳态以及成骨-破骨之间的平衡[11]。因此，构建高效的组织工程骨，必须同时兼顾血管化和成骨两者因素[12]。
目前，组织工程骨血管化策略主要有利用生长因子促进血管生成、添加血管生成相关细胞、显微外科技术移植血管、支架预血管化等。在上述方法中，基于血管种子细胞和成骨细胞共培养构建预血管化组织工程骨越来越受重视[13-14]。BMSCs因具有多向分化性能，已被作为种子细胞广泛应用于构建组织工程骨，但仍未克服支架内部血管化不良的缺陷[15]。既往研究多将人脐带静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）作为血管种子细胞，加快骨修复血管化进程，但HUVECs分化能力有限，且临床实际应用中其来源受到极大限制[16-17]。EPCs是内皮细胞的前体细胞，可分化为成熟血管内皮细胞而生成血管，是组织工程支架血管化最具有潜力的种子细胞之一[18]。研究表明，可利用BMSCs和EPCs共培养的协同效应提高组织工程骨血管生成和骨修复能力[19]。Liang等[20]研究发现，BMSCs和EPCs在体外共培养后，血管生成相关基因和成骨相关基因表达水平显著升高，复合支架植入体内后可见更多的新生血管和新生骨组织。也有研究证实，BMSCs的存在有利于EPCs在组织工程支架上的微血管网络生成，且BMSCs也可以作为血管周细胞维持新生血管功能的稳定性[21]。因此，本研究选择自体EPCs和BMSCs进行直接接触共培养，体外构建预血管化组织工程骨。体外实验结果显示BMSCs的存在显著提升了 EPCs成管能力，二者协同作用，促进了种子细胞在骨修复支架的黏附和功能发挥，表明EPCs/BMSCs共培养体系有助于体外预血管化组织工程骨的构建。体内实验结果显示预血管化组织工程骨的血管参数评估明显优于对照组，植入8周后支架内部已基本完成整体血管化，提示预血管化组织工程骨植入体内后可以缩短新生血管网络形成时间，提高支架内部血管化进程。这对于骨修复支架，尤其是大块组织工程骨支架的活化和骨组织再生具有重要意义。Kawecki等[22]采用预血管化类骨组织修复大鼠颅骨缺损，结果显示该方法显著提高了移植骨的存活率和骨缺损修复效果。
组织工程骨支架内部血管化的精确定量评估一直是骨组织工程研究难点之一。既往研究采用免疫荧光/免疫组织化学染色技术对血管进行标记，但无法对血管全貌以及功能形态进行评价[23]。本课题组前期研究提出了基于Microfill血管灌注、Micro-CT扫描重建以及荧光背景下血管成像的“骨内微血管可视化研究模型” 构建技术[8-9]。基于该方法，本次研究体内实验对构建的预血管化组织工程骨内微血管形成参数进行了定量评估，进一步表明了BMSCs/EPCs共培养对骨修复支架血管化进程具有显著促进作用。有研究指出，EPCs可在体外形成预构型血管网络，植入体内后可迅速与宿主血管形成对接，直接改善支架内部的血管参数，也可通过释放血管生成因子招募宿主EPCs形成新生血管，间接改善支架内部的血管参数[24]。值得注意的是，本研究所采取的BMSCs和EPCs均来源于自体骨髓，应用于人体时不存在伦理问题，且操作简便，具有很好的临床转化潜能。
本研究存在如下局限性：① 研究关注于骨修复血管化进程，旨在评估 EPCs/BMSCs共培养构建的预血管化组织工程骨植入动物体内后内部血运恢复效果。由于研究采取的荧光背景下血管成像技术涉及到骨脱钙过程，因此未对骨组织进行定量评估。② 本研究尚未阐明EPCs/BMSCs促进血管化进程的具体分子机制，有待进一步深入研究。
综上述，EPCs/BMSCs共培养可促进种子细胞的黏附、增殖和成管等生物学行为，利用二者构建的预血管化组织工程骨在植入体内后能促进骨修复血管化进程。该方法为骨缺损尤其是大段骨缺损的修复重建提供了新思路。
利益冲突 在课题研究及文章撰写过程中不存在利益冲突；基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计学分析及其报道
伦理声明 研究方案经中国人民解放军空军军医大学第一附属医院伦理委员会批准（KY20193269-1）；实验动物使用许可证号：SYXK（陕）2019-001
作者贡献声明 黄孟全：研究设计、实施及文章撰写；樊简、马子扬：参与研究实施及数据收集；鲁亚杰、李靖：研究设计、评估以及文章审阅
