引用本文： 何树坤, 秦廷武. 肩袖损伤修复的界面组织工程研究进展. 中国修复重建外科杂志, 2021, 35(10): 1341-1351. doi: 10.7507/1002-1892.202104064 复制
肩袖损伤是导致肩关节持续性疼痛和功能障碍的主要原因之一，其发病率为 5%～40%，50 岁以上人群高达 50%[1-2]。目前研究发现肩袖损伤有以下几种发病机制：一是存在解剖异常（例如肩峰撞击综合征），冈上肌经常受到肩峰和喙肩韧带挤压，进而导致水肿断裂等病理变化[3]；二是存在慢性炎症，炎症能使冈上肌腱的超微结构发生改变，进而导致肌腱钙化断裂等[4]；三是存在其他危险因素，包括吸烟[5]、基质金属蛋白酶功能活跃[6]和基因表达改变[7]等。对于保守治疗失败和不适合保守治疗的患者，手术修复是一种有效手段，然而系统评价结果显示肩袖修复术后平均不愈合率为 26.6%，并且大型（3～5 cm）和巨大型（>5 cm）肩袖撕裂患者术后再断裂率高达 79%[8-9]。研究发现影响术后肩袖是否再断裂的因素有很多，包括年龄、肌腱质量、骨密度、肌肉萎缩程度、脂肪浸润程度、撕裂大小和病程长短等[10-12]。
为了更好地了解肩袖损伤修复术后再断裂原因，我们首先要了解肩袖的正常结构以及肩袖损伤部位特点。正常肩袖是由冈上肌、冈下肌、小圆肌和肩胛下肌组成，这些肌肉均起于肩胛骨，而肌腱则汇合成一个薄片即肩袖，最终止于肱骨大、小结节，其功能是维持肩关节稳定和协助完成肩关节的内、外旋和外展运动[13]。冈上肌腱因其特殊的解剖位置和止点处缺少血供的生理特点，是肩袖中最容易发生损伤的肌腱[14]，其最常断裂部位是肌腱和骨之间的连接处即腱骨界面，并且肩袖修复术后腱骨界面不愈合是导致手术失败的主要原因之一[15]。腱骨界面是一个包括肌腱、纤维软骨、矿化纤维软骨和骨 4 种不同类型组织的不均匀区域，是一个细胞、结构组成以及力学性能各异的部位[16]。其中，肌腱细胞分布在含有Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的肌腱组织内；纤维软骨细胞则沿着胶原纤维的长轴排列，分布在含有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅸ型和Ⅹ型胶原蛋白的非矿化纤维软骨区域；而含有Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅹ型胶原蛋白的矿化纤维软骨中可见肥大软骨细胞，且呈柱状排列；最后，含有Ⅰ型胶原蛋白的骨中可见成骨细胞、骨细胞和破骨细胞。除此之外，各个区域中矿物质含量和蛋白多糖种类也各有不同，而这种天然的异质性导致此界面组织的力学和生物学特性发生变化，有效降低了应力集中，允许载荷从肌腱或韧带转移到骨骼中[17-18]。
近年来，界面组织工程研究的出现给腱骨界面修复和再生带来新的机遇，该研究旨在通过多种方法重建复杂的、层次分明的界面组织，修复或再生受损的不同组织连接部位[19]。界面组织工程主要由种子细胞、生长因子、生物材料三要素构成。种子细胞是源头，即细胞通过迁移、黏附、增殖和分化等行为来实现缺损组织的再生；生长因子是调控，即因子通过作用于特定的信号通路来调控细胞的多种行为；生物材料是桥梁，即材料一方面可以为种子细胞提供适当的生长环境，另一方面可以为生长因子提供载体。除了上述三要素，适宜的氧浓度和力学刺激也会影响细胞的生物学行为和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）沉积等[20-21]。见表 1。本文拟从上述方面对肩袖损伤修复的界面组织工程研究进展进行综述。
表1
肩袖损伤修复的界面组织工程进展
Table1.
Research progress of interfacial tissue engineering in rotator cuff repair
1 种子细胞
目前用于界面组织工程的种子细胞类型包括干细胞和终末分化细胞，细胞培养策略则包括单独培养和共培养，最佳的细胞来源以及共培养中合适的细胞比例仍在探索中。
1.1 单独培养
单独培养研究主要集中在干细胞方面，相对于终末分化细胞，干细胞具有自我复制能力以及向不同谱系细胞分化的能力，目前研究较多的是 BMSCs 和脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）。
BMSCs 是目前研究最为广泛的一种干细胞，来源于骨髓，参与肩袖腱骨界面的修复和再生。在动物实验方面，Lim 等[22]用包含 BMSCs 的纤维蛋白胶包裹自体肌腱重建兔前交叉韧带，术后实验组可观察到成熟的软骨区存在，且力学性能显著提高。Kida 等[23]通过转孔的方法将肩袖止点的自体 BMSCs 应用于大鼠冈上肌腱止点修复，术后发现转孔组腱骨界面力学性能更好。在临床试验方面，Hernigou 等[24]设计了病例对照研究，观察注射 BMSCs 能否提高肩袖损伤修复效果，结果发现注射组患者术后 6 个月和 10 年的肩袖损伤愈合率均高于对照组。其他研究也同样表明 BMSCs 的应用能改善腱骨界面的力学性能[25-26]。然而有学者发现在修复大鼠肩袖腱骨界面实验中，单独应用 BMSCs 并未促进腱骨界面的愈合或提高界面的力学强度[27]。因此在后续研究中，该团队通过腺病毒转染制备了 SCX（scleraxis）和膜型基质金属蛋白酶 1（membrane-type 1 matrix metalloproteinase，MT1-MMP）过表达的 BMSCs 用于腱骨界面修复，结果发现过表达组存在更多新生纤维软骨组织和更高力学强度[28-29]。同时，其他学者通过编码 shRNA 的腺病毒制备了 TOB1（transducer of ERBB2.1）缺陷的 BMSCs 用于大鼠肩袖损伤修复，结果发现实验组存在更多纤维软骨和Ⅱ型胶原，并且腱骨界面力学强度更好[30]。然而有学者发现，BMP-13 过表达的 BMSCs 未能促进腱骨界面愈合[31]。上述研究说明 BMSCs 可能需要特定的诱导才能发挥其促进肩袖腱骨界面损伤修复的作用。
尽管 ADSCs 未直接参与肩袖腱骨界面的修复，但其来源广泛、相关并发症少，并且也具有成骨、成软骨和成肌腱等多向分化潜能，因此 ADSCs 也是有研究前景的干细胞之一[32-33]。在动物实验方面，Oh 等[34]使用 ADSCs 修复兔肩胛下肌腱损伤，结果发现局部注射 ADSCs 能够改善肩袖损伤后的肌肉功能和促进肌腱愈合，并减少脂肪浸润。Kosaka 等[35]将 ADSCs 局部注射至兔前交叉韧带重建模型中，同样促进了肌腱-骨的整合。在临床试验方面，Kim 等[36]设计了队列研究观察注射含 ADSCs 的纤维蛋白胶能否提高关节镜术后肩袖损伤修复效果，结果发现相比于对照组，注射组患者术后肩袖再断裂率明显降低。Jo 等[37]对比了不同注射浓度 ADSCs 的安全性和有效性，术后 2 年随访结果发现，注射高浓度（1×108 个）ADSCs 不会出现相关并发症，并且能够减轻疼痛，改善肩袖肌肉力量和提高肩关节临床功能评分。其他研究也同样表明 ADSCs 能促进腱骨界面损伤的修复再生[38-40]。
除了上述两种干细胞，近年来学者们发现肌腱来源干细胞（tendon-derived stem cells，TDSCs）[41]、韧带来源干细胞[42]、滑膜来源干细胞[43]、骨膜来源干细胞[44]和尿源性干细胞[45]在腱骨界面修复中也显示出巨大潜能。
1.2 共培养
由于腱骨界面包含细胞种类较多，相对于单一细胞研究，研究细胞间的共培养能够了解腱骨界面的发育和修复过程，因此共培养策略的研究与应用尤为重要。目前，界面组织工程中共培养策略分为直接接触共培养和间接接触或非接触共培养，所选细胞则分为终末分化细胞间的共培养和终末分化细胞与干细胞间的共培养[46]。直接接触共培养存在细胞与细胞间相互作用、旁分泌因子对细胞的作用以及细胞与 ECM 间的作用，机制研究较为困难。而间接接触或非接触共培养的细胞由多孔膜分离，可以单独研究旁分泌因子对细胞的作用或 ECM 对细胞的作用[46]。对于终末分化细胞间的共培养，Wang 等[47]利用直接接触共培养模型研究了成骨细胞和成纤维细胞之间的相互作用，在培养过程中两种细胞能够迁移并相互作用形成 3 个不同区域：成纤维细胞区、成纤维细胞+成骨细胞区和成骨细胞区。该研究发现成纤维细胞的 ALP 活性和矿化可能受到成骨细胞的影响；此外，相对于两侧区域细胞，中间区域细胞的Ⅱ型胶原、聚蛋白多糖（aggrecan，ACAN）和软骨寡聚基质蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）基因表达水平上调。Cooper 等[48]通过调整培养基的组成成分共培养了 NIH-3T3 成纤维细胞系和 MC-3T3 成骨细胞系，从而制备出具有 3 个不同区域的支架来模拟腱骨界面的天然结构。对于终末分化细胞与干细胞间的共培养，He 等[49]在丝素蛋白-羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）支架上共培养兔成纤维细胞、BMSCs 和成骨细胞，将支架分为 4 个不同区域：成纤维细胞区、成纤维细胞+BMSCs 区、成骨细胞+BMSCs 区、成骨细胞区，结果发现 BMSCs 与成骨细胞和成纤维细胞共培养时向纤维软骨细胞系分化。Calejo 等[50]发现基础培养基和成骨诱导培养基不同混合比例会影响人肌腱来源细胞和前成骨细胞共培养时的基因表达，成骨诱导培养基比例提高能够显著增强共培养细胞的 ALP 表达、矿物沉积以及成软骨相关标志物（ACAN 和 COMP）表达，同时使人肌腱来源细胞表型发生成骨转化。Lyu 等[51]设计了一种树形微流体装置，该装置可以将普通培养基和成骨诱导培养基合并成具有梯度浓度比例的混合液，从而诱导接种于脱细胞肌腱片上的 BMSCs 和 TDSCs 向成骨、成软骨及成肌腱方向分化，最终在材料表面形成 3 个不同区域，大鼠跟腱缺损修复研究结果表明，该装置所制备的新型材料能够促进腱骨界面愈合。
尽管前期研究已揭示出肌腱和骨组织中的细胞类型，但位于腱骨界面的细胞呈现出与上述两种细胞不同的特征。既往研究通过转录组学和蛋白质组学结果揭示出腱骨界面细胞表达软骨相关标记物（包括 ACAN、软骨黏附素、Ⅱ型胶原等）以及终末分化的肥大样软骨细胞标记物 ［例如 Runt 相关转录因子 2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2），整合素结合唾液蛋白和基质金属蛋白酶 13（matrix metal proteinase 13，MMP-13）等］，从而提示该类型细胞属于软骨细胞样表型[52]。然而迄今为止，由于缺少针对腱骨界面细胞亚群的单细胞测序研究，我们对于腱骨界面发育和再生的机制仍缺乏了解，而共培养是研究体外细胞相互作用的重要方法，因此下一步应通过模拟腱骨界面处的微环境，研究多个细胞间的相互作用，相比于直接接触共培养，使用间接接触共培养或非接触共培养可能是一种比较好的研究方法。
2 生长因子
生长因子是细胞增殖、迁移、分化和 ECM 沉积的调节因子，在组织修复和再生中发挥着重要作用[53]。在腱骨界面愈合过程中，不同区域生长因子类型和表达也各有不同，因此为了与种子细胞和生物材料相配合增强修复效果，生长因子的正确组合、有效浓度和释放时间均需要进行深入研究。
2.1 单一组分应用
目前研究中的生长因子包括 BMP（如 BMP-2、BMP-4 和 BMP-7）、TGF（如 TGF-β1 和 TGF-β3）、PDGF（如 PDGF-BB）、FGF（如 FGF-2）和集落刺激因子［如粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）］等。
Hirakawa 等[54]使用复合 BMP-2 的磷酸三钙（tricalcium phosphate，TCP）支架修复兔冈下肌腱损伤，结果发现 BMP-2 能够促进纤维软骨生成、腱骨界面愈合并提高力学强度。Lee‐Barthel 等[55]发现 BMP-4 能够通过改变腱骨界面处的细胞表型（肌腱/韧带转变为纤维软骨），提高腱骨界面的极限断裂载荷。Kabuto 等[56]发现与单纯注射 BMP-7 相比，BMP-7 缓释更有利于软骨基质生成和肌腱取向排列，并且缓释组具有更高的腱骨成熟评分和更大的力学强度。其他学者同样发现 TGF-β1 或 TGF-β3 的缓释能够促进修复部位更好的胶原排列和新的纤维软骨形成，从而促进腱骨界面愈合，提高力学强度[57-58]。Tokunaga 等[59]使用含有 PDGF‑BB 的膜状水凝胶修复大鼠冈上肌腱损伤，结果发现 PDGF‑BB 能够增加增殖细胞核抗原阳性细胞数目，改善胶原排列取向，进而增强腱骨界面的力学强度。Yonemitsu 等[60]同样发现 FGF-2 能够促进干细胞增殖，即增加腱骨界面处 SCX 和腱调蛋白（tenomodulin，TNMD）阳性细胞数目，从而提高腱骨界面力学强度。Kobayashi 等[61]发现大鼠皮下注射 G-CSF 能够动员 BMSCs 从骨髓通过外周血迁移至冈上肌腱损伤部位参与修复，提高软骨基质沉积和腱骨界面力学强度。
2.2 两种组分应用
除了单一生长因子的使用，近年来出现了两种生长因子联合应用。Min 等[62]设计了具有双重反向生长因子浓度梯度（PDGF-BB 梯度从膜的左侧到右侧和 BMP-2 梯度从膜的右侧到左侧）的多孔膜支架，将 ADSCs 接种在支架材料表面进行培养，结果发现细胞会根据材料上生长因子的浓度梯度向成肌腱和成骨方向进行特定分化。
2.3 混合组分应用
富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）富含大量血小板和多种生长因子，包括 VEGF、PDGF、TGF-β 和 IGF-1 等，这些因子能够促进肌腱、韧带、肌肉和骨骼的愈合[63]。Kesikburun 等[64]采用双盲随机对照试验比较了 PRP 和安慰剂对于部分或完全肩袖撕裂患者的治疗效果，术后 1 年随访结果显示，PRP 组和安慰剂组患者在疼痛缓解和肩关节功能改善上无明显差异。Shams 等[65]采用随机对照试验比较了 PRP 和类固醇激素对于有症状的部分肩袖撕裂患者的治疗效果，结果显示 PRP 组患者在术后 12 周临床评分改善更明显，但在术后 6 个月时两组间评分相似。最新的一项纳入 16 个随机对照试验的系统评价结果显示，PRP 的应用不仅能够降低小型和中型肩袖撕裂患者术后再撕裂率，还能改善大型和巨大型肩袖撕裂患者手术失败率[66]。然而 PRP 对肩袖损伤修复的作用仍然存在争议，并且 PRP 中各种生物活性物质的作用机制或注射浓度尚未明确，仍需要进一步研究。
外泌体是直径为 30～100 nm 的囊泡样小体，可由内皮细胞、免疫细胞和骨骼肌细胞等多种细胞释放[67]。不同细胞产生包含各自独特信息的外泌体，通过自分泌或旁分泌方式传递各自信息，包括调控蛋白、生长因子、mRNA 和 miRNA 等[68]。前期研究发现外泌体中的 miRNA 能够改变细胞表型和功能，参与免疫反应，影响细胞增殖和迁移以及血管生成等生物学过程[69]。Sevivas 等[70]发现 BMSCs 来源外泌体能在体外促进肌腱细胞增殖，体内促进肌腱成熟，提高腱骨界面力学强度，从而促进大鼠慢性肩袖损伤修复。Huang 等[71]通过尾静脉注射 BMSCs 来源外泌体观察大鼠肩袖损伤修复情况，结果发现 BMSCs 来源外泌体通过促进血管生成和抑制炎症，从而促进腱骨界面愈合。Wang 等[72]发现局部注射 ADSCs 来源外泌体能够阻止脂肪浸润进展，促进腱骨愈合，改善肩袖生物力学性能。Chen 等[73]使用包含 BMSCs 条件培养基 ［含有 BMSCs 分泌产物（如外泌体等）的培养基］ 的明胶水凝胶修复大鼠冈上肌腱损伤，结果发现 BMSCs 条件培养基能通过 Smad2/3 信号通路调控巨噬细胞的激化，促进 M1 型巨噬细胞向 M2 型巨噬细胞转化，从而加速腱骨界面愈合。Li 等[74]发现 TDSCs 来源外泌体中富含大量 TGF-β，能够激活 TGF-β/Smad2/3 和细胞外调节激酶 1/2（extracellular-regulated kinase 1/2，ERK1/2）信号通路，从而促进 TDSCs 增殖和迁移。Zhang 等[75]同样发现 TDSCs 来源外泌体通过磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶 B（PI3K/AKT）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/ERK1/2 信号通路促进肌腱细胞增殖和迁移，并且体内研究发现 TDSCs 来源外泌体早期能够抑制炎症和细胞凋亡，晚期能够通过改善纤维排列方向提高再生肌腱的质量。
目前研究显示应用单一或多种生长因子、PRP 或外泌体均能提高腱骨界面修复组织的质量。然而考虑到腱骨界面的复杂性，组织再生修复过程中很可能存在多种生长因子在不同时间和位置协同作用[76-77]。因此，为了能够重建腱骨界面，研究多种生长因子的组合或探究 PRP 和外泌体促进修复的作用机制尤为重要。
3 生物材料
为了能够促进或再生肌腱与骨之间的界面，理想的界面组织工程再生策略对支架材料提出以下要求：第一，尽可能重现组织界面的多区域结构，包括基质组成、微观结构以及力学特点等；第二，支架能够支持不同种类干细胞或祖细胞的黏附、增殖和特定表型的分化；第三，支架应具有可降解性，且降解速率与组织再生速率相当，能够继续维持生理负荷；第四，支架的设计还需考虑临床可操作性，与相应的修复重建手术匹配[78]。目前已有多种技术用于设计复合支架材料，包括电纺丝技术、纺织技术（例如针织或编织）、3D 打印技术、冷冻干燥技术和其他技术（例如挤压盐浸技术或熔压技术）等。
3.1 电纺丝技术
Li 等[79]使用电纺丝技术制备聚左旋乳酸［poly（L-lactic acid），PLLA］/HA 双层支架来模拟腱骨界面的非矿化区和矿化区，体内实验证实该支架能够促进界面不同组织再生。Li 等[80]使用电纺丝技术制备出聚乙丙交酯 ［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］纤维支架，通过改变材料在模拟体液的浸泡时间，进一步制备矿物含量呈梯度变化的 PLGA 支架；Liu 等[81]发现矿物含量梯度变化的支架能够在空间上调控 ADSCs 成骨分化程度。Samavedi 等[82]同样通过混电纺丝技术制备出具有梯度的纳米羟基磷灰石/聚己内酯/聚氨酯（nano hydroxyapatite/polycaprolactone/polyurethane，nHA-PCL/PU）混合支架来模拟韧带与骨之间的界面。Lipner 等[83]为了提高支架修复效果，进一步将包含 ADSCs 的纤维蛋白水凝胶置于具有矿物含量梯度变化的 3 层 PLGA 支架中构建多层复合支架。Calejo 等[84]证实了 ADSCs 在湿纺丝技术制备的 PCL/明胶/HA 梯度膜的肌腱区域呈现伸长的细胞骨架和胶原沉积，而在梯度膜的骨区域呈现成骨分化和矿化沉积。
3.2 纺织技术
Nishimoto 等[85]通过手工编织方法制备了 PLLA 支架材料，用于修复兔内侧副韧带损伤，结果发现该支架材料能够通过促进Ⅰ型胶原沉积和纤维软骨再生，提高腱骨界面力学强度。Mengsteab 等[86]通过将聚对苯二甲酸乙二醇酯纱线和 PLLA 纱线混合编织出力学性能优越的材料用于兔前交叉韧带修复，结果证实该支架增强了材料与骨之间的整合以及腱骨界面的再生。Kimura 等[87]进一步将 PLLA 和含有 FGF-2 的明胶水凝胶编织成混合支架并用胶原膜包裹，用于修复兔前交叉韧带，结果发现 FGF-2 的释放提高了编织支架的修复效果，促进了组织再生，提高了腱骨界面力学强度。Gwiazda 等[88]采用熔解电纺丝取向纤维制备技术设计了不同取向排列的 PCL 纤维膜，并将细胞接种在纤维膜表面进行培养，构成细胞-支架复合物，进一步通过编织方法制备出具有骨-韧带-骨结构的支架，韧带部分是由 3 束包含细胞的纤维膜编织而成，骨部分是由包含细胞的相互垂直纤维排列的膜构成。
3.3 3D 打印技术
近年来 3D 打印技术的出现给界面组织工程注入新的活力。Park 等[89]使用 3D 打印技术制备出 PCL/PLGA/β-TCP 复合支架，动物实验证实该支架促进了腱骨界面纤维软骨再生以及Ⅱ型胶原生成。Tarafder 等[90]进一步将含有生长因子的微球载体复合在薄膜状 3D 打印支架上，通过多种生长因子的释放募集宿主 TDSCs 参与腱骨界面的再生，提高支架修复效果。Jiang 等[91]则将含有 ADSCs 的水凝胶注射于 3D 打印 PLGA 3 层支架中构建复合支架，研究证实该复合支架能够促进 ADSCs 增殖和腱向分化，同时也具有良好的组织相容性。Cao 等[92]进一步将含有成纤维细胞、BMSCs 和成骨细胞的甲基丙烯酸明胶负载于 3D 打印 PCL/TCP 三相支架的相应区域，构建细胞-支架复合物，小鼠皮下埋植实验结果表明复合支架内部有纤维软骨组织形成。为了模拟韧带、骨和纤维软骨界面组织，Criscenti 等[93]联合 3D 打印和电纺丝技术制备出物理和力学性能梯度变化的 PLGA/PCL 三相支架，该支架包括取向的 PLGA 电纺丝区域、PCL 3D 打印区域以及电纺丝-3D 打印混合区域。
3.4 其他技术
除此之外，Kim 等[94]使用冷冻干燥技术制备出 4 层胶原复合支架，包括肌腱胶原层、含有胶原和硫酸软骨素的未矿化纤维软骨层、含有少量 HA 的矿化纤维软骨层以及含有胶原和大量 HA 的骨层，该支架在微环境和力学性能上呈现渐变趋势，并支持多种细胞的黏附和增殖。Font Tellado 等[95]通过联合定向冷冻、冷冻干燥和盐浸技术制备出具有双孔隙率的双相丝素蛋白支架，该支架在肌腱/韧带侧具有取向的孔排列，而在骨侧具有随机的孔排列，体外实验证实其具有良好的细胞相容性。Lee 等[96]采用挤压-盐浸法制备多孔柱状聚乳酸-共聚己内酯支架，并通过肝素水凝胶将成纤维细胞负载在支架的韧带部分，以及将纤维软骨细胞和 BMP-2 结合在支架的纤维软骨部分，动物实验证实该支架促进纤维软骨区域钙和糖胺聚糖沉积，同时促进韧带区域胶原沉积。Guo 等[97]采用熔压技术制备了含有磷酸钙硅酸盐（calcium phosphate silicate ceramic，CPS）的 PLLA 复合膜用于兔冈上肌腱损伤修复，结果发现体积比为 5∶1 的 PLLA/CPS 复合膜不仅具有良好生物相容性、生物降解性和力学性能，还促进了胶原的取向排列以及软骨和骨的再生。
目前电纺丝技术常与纺织或编织方式联合应用，其原因可能是该技术可以模仿不同腱骨组织的纳米纤维结构；3D 打印技术可以通过生物墨水和纤维联合设计多种支架，然而该技术还需要进一步研究来提高支架的力学性能和微观结构；冷冻干燥技术虽然可以获得高孔隙率支架，但与其他方法相比，支架力学性能较差，需要与其他方法相结合。
4 氧浓度
在人体中，氧是多种组织器官发育和维持的重要因素。肌腱与骨组织之间的界面存在一个逐渐过渡的血管组织结构，相应的软组织和硬组织之间也出现氧浓度变化，骨组织因血供比较丰富，故氧浓度为 5.5%～15%，而肌腱组织缺乏血供，故氧浓度<5%[98-99]。
目前对于氧浓度的研究主要集中在低氧环境对干细胞成肌腱、成软骨和成骨分化的影响。Zhang 等[100]比较了人 TDSCs 在低氧（5%）和常氧（20%）环境下的生物学行为，结果发现低氧环境能促进 TDSCs 的增殖和成肌腱分化，但抑制了 TDSCs 的成骨和成软骨分化。Yu 等[20]比较了不同氧浓度（0.5%、5%、10% 和 20%）对 TDSCs 克隆能力和分化能力的影响，结果发现氧浓度为 5% 时，TDSCs 的克隆能力和增殖能力最强；氧浓度为 0.5% 时，TDSCs 的克隆能力受到抑制，但是干细胞相关基因 ［Nanog、Oct-4（octamer-binding transcription factor 4）和阶段特异性胚胎抗原 4（SSEA-4）］的表达反而增强；氧浓度为 20% 时，TDSCs 成脂、成软骨和成骨相关基因 ［过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）、Sry 相关高迁移率族盒蛋白 9（Sox-9）和 Runx2］表达水平较高。Lee 等[101]比较了 TDSCs 在低氧（2%）和常氧（20%）环境下的生物学行为，结果发现低氧促进了细胞增殖能力和成肌腱分化，但降低了细胞成骨、成脂和成软骨分化。Yu 等[102]进一步比较了低氧（2%）和常氧（20%）对肌腱细胞和 ADSCs 间接共培养时的影响，结果发现间接共培养时，肌腱细胞能够增强 ADSCs 的成肌腱分化，而且低氧环境进一步通过促进缺氧诱导因子 1 α 基因表达来促进 ADSCs 成肌腱相关基因［SCX、TNMD 和血小板反应蛋白 4（THBS-4）］的表达。尽管前期研究发现低氧会降低干细胞成骨分化，但是部分学者发现低氧（1% 或 5%）环境会增强 BMSCs 的成骨分化[103-104]。故低氧对干细胞成骨分化的影响仍需进一步研究。
组织损伤往往伴随着血供缺乏，从而导致周围环境出现氧含量不足，在外源性细胞和生物材料植入修复早期，尽管细胞会分泌血管生长因子促进新生血管形成，然而如该过程较长会导致植入细胞死亡[105]。为了改善损伤组织的极度低氧环境，目前已有学者制备出能够局部释放氧气的支架材料用于修复损伤组织。Touri 等[106]用 3D 打印技术制备出含有过氧化钙-PCL 颗粒的双相 HA/磷酸钙支架用于骨损伤修复，结果显示在缺氧条件下，该支架能够长时间（10 d）缓慢增加周围环境的氧含量，促进成骨细胞增殖。Montesdeoca 等[107]同样发现含有过氧化钙的明胶甲基丙烯酸水凝胶能够持续（6 d）释放氧气，改善缺氧条件下软骨细胞的存活率。Wang 等[108]将含有过氧化钙的明胶微球和含有 BMSCs 的海藻酸钠/明胶水凝胶复合在 3D 打印多层多孔管状 PCL/nHA 支架内部，构建细胞-支架复合物并用于修复兔股骨头坏死。体外研究结果发现该复合支架能够长时间（19 d）持续释放氧气，并且能够维持 BMSCs 在低氧环境（1%）下的增殖；体内研究结果证实与不含过氧化钙微球的支架相比，该复合支架能够提高外源性 BMSCs 的存活率，减少细胞凋亡，从而促进骨组织和血管再生。
总的来说，培养环境中的氧浓度对干细胞的命运起着非常重要的作用，然而由于目前研究缺乏统一的实验参数和干细胞种类，不同氧浓度对于干细胞的分化作用仍需要进一步研究。此外，腱骨界面不仅在细胞、结构组成以及力学性能方面具有梯度变化，细胞所处的氧环境也具有相似变化，未来研究需要同时关注肌腱和骨组织中的氧浓度，在设计相应支架时还要考虑寻找一合适氧浓度来支持相应部位细胞的成肌腱、成软骨和成骨表型。
5 力学刺激
除了组织环境中的氧浓度会影响损伤组织修复，力学刺激也会对腱骨界面组织的发育和再生起到重要作用。在生物发育阶段，力学刺激影响骨、软骨和肌腱的发育，对于骨来说，力学刺激增加（例如体力活动）会导致骨密度增加，力学刺激减少（例如石膏固定和卧床休息等）则会导致骨密度降低[109]。对于软骨和肌腱来说，力学刺激对软骨和肌腱的发育、稳态及功能至关重要，去除力学刺激会损害软骨和肌腱的结构，从而导致相应疾病发生[110-111]。部分学者通过 A 型肉毒杆菌毒素麻痹大鼠冈上肌，观察力学刺激在肩袖损伤修复中的作用，结果发现与生理盐水注射组相比，肌肉麻痹组冈上肌体积减少，界面的纤维软骨发育延迟，矿化骨也减少，同时破骨细胞活性增高，从而延缓了腱骨界面的发育[21]。显而易见，来自肌肉和肌腱的力学刺激有助于腱骨界面结构发育，从而形成具有力学性能梯度变化的结构，实现有效的力学传递和降低应力集中。
在组织工程领域，已有学者使用动态培养（例如生物反应器）方法对细胞施加不同力学刺激，来模拟人体生理器官的力学环境，诱导细胞增殖、分化以及体外形成新的组织用于修复[112]。Elashry 等[113]将 ADSCs 接种于二氧化硅/胶原纳米复合材料，并将细胞-支架复合物放入生物反应器中培养，结果发现流体剪切应力能够促进 BMSCs 的 ALP 以及成骨相关基因（Runx2）表达。除了通过生物反应器的方法使细胞感受力学刺激外，目前有学者制备出能够感受外来刺激（例如磁场或超声波），从而使自身结构发生变化的支架用于组织修复。Min 等[114]通过模板辅助电沉积和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）三肽复合技术制备出具备磁性的钴铁纳米线圈，在外来磁场作用下，纳米线圈具有“开”和“关”两种形态，体外研究结果发现纳米线圈在“开”的形态下能够促进 MSCs 黏附，并通过 Yes 相关蛋白与转录共激活因子 PDZ 结合基序（YAP/TAZ）力学传导通路促进干细胞成骨分化；体内研究结果发现在外来磁场作用下，裸鼠皮下埋植的磁性纳米线圈仍然能够促进注射在材料表面的 MSCs 黏附以及成骨相关基因（Runx2）表达。Camarero-Espinosa 等[115]使用 3D 打印技术制备了 PCL/聚乳酸混合 Janus 支架，该支架能够将外部超声产生的声学信号转换成机械纳米振动的力学信号作用于干细胞，结果发现在外来超声波作用下，Janus 支架能够促进 BMSCs 增殖、基质沉积和成骨相关基因（Runx2 和骨钙素）的表达，并且该支架是通过激活电压门控钙离子通道，从而增强 BMSCs 的成骨分化。
目前多数研究仍在探索力学刺激对于干细胞增殖、黏附、迁移和分化的影响以及相关作用机制，还未设计和制备出用于腱骨界面修复的力学刺激支架。相反，多数已设计的新型支架仅在静态细胞培养下探讨修复效果，往往忽视了力学刺激对腱骨界面愈合的影响。因此，未来研究可结合动态培养系统来控制环境中的力学刺激，从而制备具有梯度变化的材料界面，增强支架对干细胞的调控。
6 小结
近年来界面组织工程技术取得了很大进步，然而关于腱骨界面发育和再生的机制仍未探明，研究者们一直试图通过了解再生过程中所涉及的不同信号来重现界面组织的复杂性。对于种子细胞和生长因子，了解天然腱骨界面中多种细胞的相互作用尤为重要，包括细胞与细胞间的作用、细胞和 ECM 之间的作用以及旁分泌的作用。对于生物材料，可以通过多种技术手段来协同设计生物材料的特性，以模拟天然腱骨界面的微观结构、基质组成和力学特点。最后，腱骨愈合和再生的最佳策略不仅需要使用具有梯度变化的生物材料，还需要细胞、生长因子和特定培养条件（例如氧浓度和力学刺激）的结合。尽管越来越多证据表明种子细胞、生长因子和生物材料的治疗有利于腱骨界面愈合，但相应治疗手段的临床转化仍然是一个非常缓慢的过程。
作者贡献：何树坤负责资料收集和文章撰写；秦廷武负责对文章审阅和修改。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持没有影响文章观点。
肩袖损伤是导致肩关节持续性疼痛和功能障碍的主要原因之一，其发病率为 5%～40%，50 岁以上人群高达 50%[1-2]。目前研究发现肩袖损伤有以下几种发病机制：一是存在解剖异常（例如肩峰撞击综合征），冈上肌经常受到肩峰和喙肩韧带挤压，进而导致水肿断裂等病理变化[3]；二是存在慢性炎症，炎症能使冈上肌腱的超微结构发生改变，进而导致肌腱钙化断裂等[4]；三是存在其他危险因素，包括吸烟[5]、基质金属蛋白酶功能活跃[6]和基因表达改变[7]等。对于保守治疗失败和不适合保守治疗的患者，手术修复是一种有效手段，然而系统评价结果显示肩袖修复术后平均不愈合率为 26.6%，并且大型（3～5 cm）和巨大型（>5 cm）肩袖撕裂患者术后再断裂率高达 79%[8-9]。研究发现影响术后肩袖是否再断裂的因素有很多，包括年龄、肌腱质量、骨密度、肌肉萎缩程度、脂肪浸润程度、撕裂大小和病程长短等[10-12]。
为了更好地了解肩袖损伤修复术后再断裂原因，我们首先要了解肩袖的正常结构以及肩袖损伤部位特点。正常肩袖是由冈上肌、冈下肌、小圆肌和肩胛下肌组成，这些肌肉均起于肩胛骨，而肌腱则汇合成一个薄片即肩袖，最终止于肱骨大、小结节，其功能是维持肩关节稳定和协助完成肩关节的内、外旋和外展运动[13]。冈上肌腱因其特殊的解剖位置和止点处缺少血供的生理特点，是肩袖中最容易发生损伤的肌腱[14]，其最常断裂部位是肌腱和骨之间的连接处即腱骨界面，并且肩袖修复术后腱骨界面不愈合是导致手术失败的主要原因之一[15]。腱骨界面是一个包括肌腱、纤维软骨、矿化纤维软骨和骨 4 种不同类型组织的不均匀区域，是一个细胞、结构组成以及力学性能各异的部位[16]。其中，肌腱细胞分布在含有Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的肌腱组织内；纤维软骨细胞则沿着胶原纤维的长轴排列，分布在含有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅸ型和Ⅹ型胶原蛋白的非矿化纤维软骨区域；而含有Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅹ型胶原蛋白的矿化纤维软骨中可见肥大软骨细胞，且呈柱状排列；最后，含有Ⅰ型胶原蛋白的骨中可见成骨细胞、骨细胞和破骨细胞。除此之外，各个区域中矿物质含量和蛋白多糖种类也各有不同，而这种天然的异质性导致此界面组织的力学和生物学特性发生变化，有效降低了应力集中，允许载荷从肌腱或韧带转移到骨骼中[17-18]。
近年来，界面组织工程研究的出现给腱骨界面修复和再生带来新的机遇，该研究旨在通过多种方法重建复杂的、层次分明的界面组织，修复或再生受损的不同组织连接部位[19]。界面组织工程主要由种子细胞、生长因子、生物材料三要素构成。种子细胞是源头，即细胞通过迁移、黏附、增殖和分化等行为来实现缺损组织的再生；生长因子是调控，即因子通过作用于特定的信号通路来调控细胞的多种行为；生物材料是桥梁，即材料一方面可以为种子细胞提供适当的生长环境，另一方面可以为生长因子提供载体。除了上述三要素，适宜的氧浓度和力学刺激也会影响细胞的生物学行为和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）沉积等[20-21]。见表 1。本文拟从上述方面对肩袖损伤修复的界面组织工程研究进展进行综述。
表1
肩袖损伤修复的界面组织工程进展
Table1.
Research progress of interfacial tissue engineering in rotator cuff repair
1 种子细胞
目前用于界面组织工程的种子细胞类型包括干细胞和终末分化细胞，细胞培养策略则包括单独培养和共培养，最佳的细胞来源以及共培养中合适的细胞比例仍在探索中。
1.1 单独培养
单独培养研究主要集中在干细胞方面，相对于终末分化细胞，干细胞具有自我复制能力以及向不同谱系细胞分化的能力，目前研究较多的是 BMSCs 和脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）。
BMSCs 是目前研究最为广泛的一种干细胞，来源于骨髓，参与肩袖腱骨界面的修复和再生。在动物实验方面，Lim 等[22]用包含 BMSCs 的纤维蛋白胶包裹自体肌腱重建兔前交叉韧带，术后实验组可观察到成熟的软骨区存在，且力学性能显著提高。Kida 等[23]通过转孔的方法将肩袖止点的自体 BMSCs 应用于大鼠冈上肌腱止点修复，术后发现转孔组腱骨界面力学性能更好。在临床试验方面，Hernigou 等[24]设计了病例对照研究，观察注射 BMSCs 能否提高肩袖损伤修复效果，结果发现注射组患者术后 6 个月和 10 年的肩袖损伤愈合率均高于对照组。其他研究也同样表明 BMSCs 的应用能改善腱骨界面的力学性能[25-26]。然而有学者发现在修复大鼠肩袖腱骨界面实验中，单独应用 BMSCs 并未促进腱骨界面的愈合或提高界面的力学强度[27]。因此在后续研究中，该团队通过腺病毒转染制备了 SCX（scleraxis）和膜型基质金属蛋白酶 1（membrane-type 1 matrix metalloproteinase，MT1-MMP）过表达的 BMSCs 用于腱骨界面修复，结果发现过表达组存在更多新生纤维软骨组织和更高力学强度[28-29]。同时，其他学者通过编码 shRNA 的腺病毒制备了 TOB1（transducer of ERBB2.1）缺陷的 BMSCs 用于大鼠肩袖损伤修复，结果发现实验组存在更多纤维软骨和Ⅱ型胶原，并且腱骨界面力学强度更好[30]。然而有学者发现，BMP-13 过表达的 BMSCs 未能促进腱骨界面愈合[31]。上述研究说明 BMSCs 可能需要特定的诱导才能发挥其促进肩袖腱骨界面损伤修复的作用。
尽管 ADSCs 未直接参与肩袖腱骨界面的修复，但其来源广泛、相关并发症少，并且也具有成骨、成软骨和成肌腱等多向分化潜能，因此 ADSCs 也是有研究前景的干细胞之一[32-33]。在动物实验方面，Oh 等[34]使用 ADSCs 修复兔肩胛下肌腱损伤，结果发现局部注射 ADSCs 能够改善肩袖损伤后的肌肉功能和促进肌腱愈合，并减少脂肪浸润。Kosaka 等[35]将 ADSCs 局部注射至兔前交叉韧带重建模型中，同样促进了肌腱-骨的整合。在临床试验方面，Kim 等[36]设计了队列研究观察注射含 ADSCs 的纤维蛋白胶能否提高关节镜术后肩袖损伤修复效果，结果发现相比于对照组，注射组患者术后肩袖再断裂率明显降低。Jo 等[37]对比了不同注射浓度 ADSCs 的安全性和有效性，术后 2 年随访结果发现，注射高浓度（1×108 个）ADSCs 不会出现相关并发症，并且能够减轻疼痛，改善肩袖肌肉力量和提高肩关节临床功能评分。其他研究也同样表明 ADSCs 能促进腱骨界面损伤的修复再生[38-40]。
除了上述两种干细胞，近年来学者们发现肌腱来源干细胞（tendon-derived stem cells，TDSCs）[41]、韧带来源干细胞[42]、滑膜来源干细胞[43]、骨膜来源干细胞[44]和尿源性干细胞[45]在腱骨界面修复中也显示出巨大潜能。
1.2 共培养
由于腱骨界面包含细胞种类较多，相对于单一细胞研究，研究细胞间的共培养能够了解腱骨界面的发育和修复过程，因此共培养策略的研究与应用尤为重要。目前，界面组织工程中共培养策略分为直接接触共培养和间接接触或非接触共培养，所选细胞则分为终末分化细胞间的共培养和终末分化细胞与干细胞间的共培养[46]。直接接触共培养存在细胞与细胞间相互作用、旁分泌因子对细胞的作用以及细胞与 ECM 间的作用，机制研究较为困难。而间接接触或非接触共培养的细胞由多孔膜分离，可以单独研究旁分泌因子对细胞的作用或 ECM 对细胞的作用[46]。对于终末分化细胞间的共培养，Wang 等[47]利用直接接触共培养模型研究了成骨细胞和成纤维细胞之间的相互作用，在培养过程中两种细胞能够迁移并相互作用形成 3 个不同区域：成纤维细胞区、成纤维细胞+成骨细胞区和成骨细胞区。该研究发现成纤维细胞的 ALP 活性和矿化可能受到成骨细胞的影响；此外，相对于两侧区域细胞，中间区域细胞的Ⅱ型胶原、聚蛋白多糖（aggrecan，ACAN）和软骨寡聚基质蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）基因表达水平上调。Cooper 等[48]通过调整培养基的组成成分共培养了 NIH-3T3 成纤维细胞系和 MC-3T3 成骨细胞系，从而制备出具有 3 个不同区域的支架来模拟腱骨界面的天然结构。对于终末分化细胞与干细胞间的共培养，He 等[49]在丝素蛋白-羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）支架上共培养兔成纤维细胞、BMSCs 和成骨细胞，将支架分为 4 个不同区域：成纤维细胞区、成纤维细胞+BMSCs 区、成骨细胞+BMSCs 区、成骨细胞区，结果发现 BMSCs 与成骨细胞和成纤维细胞共培养时向纤维软骨细胞系分化。Calejo 等[50]发现基础培养基和成骨诱导培养基不同混合比例会影响人肌腱来源细胞和前成骨细胞共培养时的基因表达，成骨诱导培养基比例提高能够显著增强共培养细胞的 ALP 表达、矿物沉积以及成软骨相关标志物（ACAN 和 COMP）表达，同时使人肌腱来源细胞表型发生成骨转化。Lyu 等[51]设计了一种树形微流体装置，该装置可以将普通培养基和成骨诱导培养基合并成具有梯度浓度比例的混合液，从而诱导接种于脱细胞肌腱片上的 BMSCs 和 TDSCs 向成骨、成软骨及成肌腱方向分化，最终在材料表面形成 3 个不同区域，大鼠跟腱缺损修复研究结果表明，该装置所制备的新型材料能够促进腱骨界面愈合。
尽管前期研究已揭示出肌腱和骨组织中的细胞类型，但位于腱骨界面的细胞呈现出与上述两种细胞不同的特征。既往研究通过转录组学和蛋白质组学结果揭示出腱骨界面细胞表达软骨相关标记物（包括 ACAN、软骨黏附素、Ⅱ型胶原等）以及终末分化的肥大样软骨细胞标记物 ［例如 Runt 相关转录因子 2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2），整合素结合唾液蛋白和基质金属蛋白酶 13（matrix metal proteinase 13，MMP-13）等］，从而提示该类型细胞属于软骨细胞样表型[52]。然而迄今为止，由于缺少针对腱骨界面细胞亚群的单细胞测序研究，我们对于腱骨界面发育和再生的机制仍缺乏了解，而共培养是研究体外细胞相互作用的重要方法，因此下一步应通过模拟腱骨界面处的微环境，研究多个细胞间的相互作用，相比于直接接触共培养，使用间接接触共培养或非接触共培养可能是一种比较好的研究方法。
2 生长因子
生长因子是细胞增殖、迁移、分化和 ECM 沉积的调节因子，在组织修复和再生中发挥着重要作用[53]。在腱骨界面愈合过程中，不同区域生长因子类型和表达也各有不同，因此为了与种子细胞和生物材料相配合增强修复效果，生长因子的正确组合、有效浓度和释放时间均需要进行深入研究。
2.1 单一组分应用
目前研究中的生长因子包括 BMP（如 BMP-2、BMP-4 和 BMP-7）、TGF（如 TGF-β1 和 TGF-β3）、PDGF（如 PDGF-BB）、FGF（如 FGF-2）和集落刺激因子［如粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）］等。
Hirakawa 等[54]使用复合 BMP-2 的磷酸三钙（tricalcium phosphate，TCP）支架修复兔冈下肌腱损伤，结果发现 BMP-2 能够促进纤维软骨生成、腱骨界面愈合并提高力学强度。Lee‐Barthel 等[55]发现 BMP-4 能够通过改变腱骨界面处的细胞表型（肌腱/韧带转变为纤维软骨），提高腱骨界面的极限断裂载荷。Kabuto 等[56]发现与单纯注射 BMP-7 相比，BMP-7 缓释更有利于软骨基质生成和肌腱取向排列，并且缓释组具有更高的腱骨成熟评分和更大的力学强度。其他学者同样发现 TGF-β1 或 TGF-β3 的缓释能够促进修复部位更好的胶原排列和新的纤维软骨形成，从而促进腱骨界面愈合，提高力学强度[57-58]。Tokunaga 等[59]使用含有 PDGF‑BB 的膜状水凝胶修复大鼠冈上肌腱损伤，结果发现 PDGF‑BB 能够增加增殖细胞核抗原阳性细胞数目，改善胶原排列取向，进而增强腱骨界面的力学强度。Yonemitsu 等[60]同样发现 FGF-2 能够促进干细胞增殖，即增加腱骨界面处 SCX 和腱调蛋白（tenomodulin，TNMD）阳性细胞数目，从而提高腱骨界面力学强度。Kobayashi 等[61]发现大鼠皮下注射 G-CSF 能够动员 BMSCs 从骨髓通过外周血迁移至冈上肌腱损伤部位参与修复，提高软骨基质沉积和腱骨界面力学强度。
2.2 两种组分应用
除了单一生长因子的使用，近年来出现了两种生长因子联合应用。Min 等[62]设计了具有双重反向生长因子浓度梯度（PDGF-BB 梯度从膜的左侧到右侧和 BMP-2 梯度从膜的右侧到左侧）的多孔膜支架，将 ADSCs 接种在支架材料表面进行培养，结果发现细胞会根据材料上生长因子的浓度梯度向成肌腱和成骨方向进行特定分化。
2.3 混合组分应用
富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）富含大量血小板和多种生长因子，包括 VEGF、PDGF、TGF-β 和 IGF-1 等，这些因子能够促进肌腱、韧带、肌肉和骨骼的愈合[63]。Kesikburun 等[64]采用双盲随机对照试验比较了 PRP 和安慰剂对于部分或完全肩袖撕裂患者的治疗效果，术后 1 年随访结果显示，PRP 组和安慰剂组患者在疼痛缓解和肩关节功能改善上无明显差异。Shams 等[65]采用随机对照试验比较了 PRP 和类固醇激素对于有症状的部分肩袖撕裂患者的治疗效果，结果显示 PRP 组患者在术后 12 周临床评分改善更明显，但在术后 6 个月时两组间评分相似。最新的一项纳入 16 个随机对照试验的系统评价结果显示，PRP 的应用不仅能够降低小型和中型肩袖撕裂患者术后再撕裂率，还能改善大型和巨大型肩袖撕裂患者手术失败率[66]。然而 PRP 对肩袖损伤修复的作用仍然存在争议，并且 PRP 中各种生物活性物质的作用机制或注射浓度尚未明确，仍需要进一步研究。
外泌体是直径为 30～100 nm 的囊泡样小体，可由内皮细胞、免疫细胞和骨骼肌细胞等多种细胞释放[67]。不同细胞产生包含各自独特信息的外泌体，通过自分泌或旁分泌方式传递各自信息，包括调控蛋白、生长因子、mRNA 和 miRNA 等[68]。前期研究发现外泌体中的 miRNA 能够改变细胞表型和功能，参与免疫反应，影响细胞增殖和迁移以及血管生成等生物学过程[69]。Sevivas 等[70]发现 BMSCs 来源外泌体能在体外促进肌腱细胞增殖，体内促进肌腱成熟，提高腱骨界面力学强度，从而促进大鼠慢性肩袖损伤修复。Huang 等[71]通过尾静脉注射 BMSCs 来源外泌体观察大鼠肩袖损伤修复情况，结果发现 BMSCs 来源外泌体通过促进血管生成和抑制炎症，从而促进腱骨界面愈合。Wang 等[72]发现局部注射 ADSCs 来源外泌体能够阻止脂肪浸润进展，促进腱骨愈合，改善肩袖生物力学性能。Chen 等[73]使用包含 BMSCs 条件培养基 ［含有 BMSCs 分泌产物（如外泌体等）的培养基］ 的明胶水凝胶修复大鼠冈上肌腱损伤，结果发现 BMSCs 条件培养基能通过 Smad2/3 信号通路调控巨噬细胞的激化，促进 M1 型巨噬细胞向 M2 型巨噬细胞转化，从而加速腱骨界面愈合。Li 等[74]发现 TDSCs 来源外泌体中富含大量 TGF-β，能够激活 TGF-β/Smad2/3 和细胞外调节激酶 1/2（extracellular-regulated kinase 1/2，ERK1/2）信号通路，从而促进 TDSCs 增殖和迁移。Zhang 等[75]同样发现 TDSCs 来源外泌体通过磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶 B（PI3K/AKT）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/ERK1/2 信号通路促进肌腱细胞增殖和迁移，并且体内研究发现 TDSCs 来源外泌体早期能够抑制炎症和细胞凋亡，晚期能够通过改善纤维排列方向提高再生肌腱的质量。
目前研究显示应用单一或多种生长因子、PRP 或外泌体均能提高腱骨界面修复组织的质量。然而考虑到腱骨界面的复杂性，组织再生修复过程中很可能存在多种生长因子在不同时间和位置协同作用[76-77]。因此，为了能够重建腱骨界面，研究多种生长因子的组合或探究 PRP 和外泌体促进修复的作用机制尤为重要。
3 生物材料
为了能够促进或再生肌腱与骨之间的界面，理想的界面组织工程再生策略对支架材料提出以下要求：第一，尽可能重现组织界面的多区域结构，包括基质组成、微观结构以及力学特点等；第二，支架能够支持不同种类干细胞或祖细胞的黏附、增殖和特定表型的分化；第三，支架应具有可降解性，且降解速率与组织再生速率相当，能够继续维持生理负荷；第四，支架的设计还需考虑临床可操作性，与相应的修复重建手术匹配[78]。目前已有多种技术用于设计复合支架材料，包括电纺丝技术、纺织技术（例如针织或编织）、3D 打印技术、冷冻干燥技术和其他技术（例如挤压盐浸技术或熔压技术）等。
3.1 电纺丝技术
Li 等[79]使用电纺丝技术制备聚左旋乳酸［poly（L-lactic acid），PLLA］/HA 双层支架来模拟腱骨界面的非矿化区和矿化区，体内实验证实该支架能够促进界面不同组织再生。Li 等[80]使用电纺丝技术制备出聚乙丙交酯 ［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］纤维支架，通过改变材料在模拟体液的浸泡时间，进一步制备矿物含量呈梯度变化的 PLGA 支架；Liu 等[81]发现矿物含量梯度变化的支架能够在空间上调控 ADSCs 成骨分化程度。Samavedi 等[82]同样通过混电纺丝技术制备出具有梯度的纳米羟基磷灰石/聚己内酯/聚氨酯（nano hydroxyapatite/polycaprolactone/polyurethane，nHA-PCL/PU）混合支架来模拟韧带与骨之间的界面。Lipner 等[83]为了提高支架修复效果，进一步将包含 ADSCs 的纤维蛋白水凝胶置于具有矿物含量梯度变化的 3 层 PLGA 支架中构建多层复合支架。Calejo 等[84]证实了 ADSCs 在湿纺丝技术制备的 PCL/明胶/HA 梯度膜的肌腱区域呈现伸长的细胞骨架和胶原沉积，而在梯度膜的骨区域呈现成骨分化和矿化沉积。
3.2 纺织技术
Nishimoto 等[85]通过手工编织方法制备了 PLLA 支架材料，用于修复兔内侧副韧带损伤，结果发现该支架材料能够通过促进Ⅰ型胶原沉积和纤维软骨再生，提高腱骨界面力学强度。Mengsteab 等[86]通过将聚对苯二甲酸乙二醇酯纱线和 PLLA 纱线混合编织出力学性能优越的材料用于兔前交叉韧带修复，结果证实该支架增强了材料与骨之间的整合以及腱骨界面的再生。Kimura 等[87]进一步将 PLLA 和含有 FGF-2 的明胶水凝胶编织成混合支架并用胶原膜包裹，用于修复兔前交叉韧带，结果发现 FGF-2 的释放提高了编织支架的修复效果，促进了组织再生，提高了腱骨界面力学强度。Gwiazda 等[88]采用熔解电纺丝取向纤维制备技术设计了不同取向排列的 PCL 纤维膜，并将细胞接种在纤维膜表面进行培养，构成细胞-支架复合物，进一步通过编织方法制备出具有骨-韧带-骨结构的支架，韧带部分是由 3 束包含细胞的纤维膜编织而成，骨部分是由包含细胞的相互垂直纤维排列的膜构成。
3.3 3D 打印技术
近年来 3D 打印技术的出现给界面组织工程注入新的活力。Park 等[89]使用 3D 打印技术制备出 PCL/PLGA/β-TCP 复合支架，动物实验证实该支架促进了腱骨界面纤维软骨再生以及Ⅱ型胶原生成。Tarafder 等[90]进一步将含有生长因子的微球载体复合在薄膜状 3D 打印支架上，通过多种生长因子的释放募集宿主 TDSCs 参与腱骨界面的再生，提高支架修复效果。Jiang 等[91]则将含有 ADSCs 的水凝胶注射于 3D 打印 PLGA 3 层支架中构建复合支架，研究证实该复合支架能够促进 ADSCs 增殖和腱向分化，同时也具有良好的组织相容性。Cao 等[92]进一步将含有成纤维细胞、BMSCs 和成骨细胞的甲基丙烯酸明胶负载于 3D 打印 PCL/TCP 三相支架的相应区域，构建细胞-支架复合物，小鼠皮下埋植实验结果表明复合支架内部有纤维软骨组织形成。为了模拟韧带、骨和纤维软骨界面组织，Criscenti 等[93]联合 3D 打印和电纺丝技术制备出物理和力学性能梯度变化的 PLGA/PCL 三相支架，该支架包括取向的 PLGA 电纺丝区域、PCL 3D 打印区域以及电纺丝-3D 打印混合区域。
3.4 其他技术
除此之外，Kim 等[94]使用冷冻干燥技术制备出 4 层胶原复合支架，包括肌腱胶原层、含有胶原和硫酸软骨素的未矿化纤维软骨层、含有少量 HA 的矿化纤维软骨层以及含有胶原和大量 HA 的骨层，该支架在微环境和力学性能上呈现渐变趋势，并支持多种细胞的黏附和增殖。Font Tellado 等[95]通过联合定向冷冻、冷冻干燥和盐浸技术制备出具有双孔隙率的双相丝素蛋白支架，该支架在肌腱/韧带侧具有取向的孔排列，而在骨侧具有随机的孔排列，体外实验证实其具有良好的细胞相容性。Lee 等[96]采用挤压-盐浸法制备多孔柱状聚乳酸-共聚己内酯支架，并通过肝素水凝胶将成纤维细胞负载在支架的韧带部分，以及将纤维软骨细胞和 BMP-2 结合在支架的纤维软骨部分，动物实验证实该支架促进纤维软骨区域钙和糖胺聚糖沉积，同时促进韧带区域胶原沉积。Guo 等[97]采用熔压技术制备了含有磷酸钙硅酸盐（calcium phosphate silicate ceramic，CPS）的 PLLA 复合膜用于兔冈上肌腱损伤修复，结果发现体积比为 5∶1 的 PLLA/CPS 复合膜不仅具有良好生物相容性、生物降解性和力学性能，还促进了胶原的取向排列以及软骨和骨的再生。
目前电纺丝技术常与纺织或编织方式联合应用，其原因可能是该技术可以模仿不同腱骨组织的纳米纤维结构；3D 打印技术可以通过生物墨水和纤维联合设计多种支架，然而该技术还需要进一步研究来提高支架的力学性能和微观结构；冷冻干燥技术虽然可以获得高孔隙率支架，但与其他方法相比，支架力学性能较差，需要与其他方法相结合。
4 氧浓度
在人体中，氧是多种组织器官发育和维持的重要因素。肌腱与骨组织之间的界面存在一个逐渐过渡的血管组织结构，相应的软组织和硬组织之间也出现氧浓度变化，骨组织因血供比较丰富，故氧浓度为 5.5%～15%，而肌腱组织缺乏血供，故氧浓度<5%[98-99]。
目前对于氧浓度的研究主要集中在低氧环境对干细胞成肌腱、成软骨和成骨分化的影响。Zhang 等[100]比较了人 TDSCs 在低氧（5%）和常氧（20%）环境下的生物学行为，结果发现低氧环境能促进 TDSCs 的增殖和成肌腱分化，但抑制了 TDSCs 的成骨和成软骨分化。Yu 等[20]比较了不同氧浓度（0.5%、5%、10% 和 20%）对 TDSCs 克隆能力和分化能力的影响，结果发现氧浓度为 5% 时，TDSCs 的克隆能力和增殖能力最强；氧浓度为 0.5% 时，TDSCs 的克隆能力受到抑制，但是干细胞相关基因 ［Nanog、Oct-4（octamer-binding transcription factor 4）和阶段特异性胚胎抗原 4（SSEA-4）］的表达反而增强；氧浓度为 20% 时，TDSCs 成脂、成软骨和成骨相关基因 ［过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）、Sry 相关高迁移率族盒蛋白 9（Sox-9）和 Runx2］表达水平较高。Lee 等[101]比较了 TDSCs 在低氧（2%）和常氧（20%）环境下的生物学行为，结果发现低氧促进了细胞增殖能力和成肌腱分化，但降低了细胞成骨、成脂和成软骨分化。Yu 等[102]进一步比较了低氧（2%）和常氧（20%）对肌腱细胞和 ADSCs 间接共培养时的影响，结果发现间接共培养时，肌腱细胞能够增强 ADSCs 的成肌腱分化，而且低氧环境进一步通过促进缺氧诱导因子 1 α 基因表达来促进 ADSCs 成肌腱相关基因［SCX、TNMD 和血小板反应蛋白 4（THBS-4）］的表达。尽管前期研究发现低氧会降低干细胞成骨分化，但是部分学者发现低氧（1% 或 5%）环境会增强 BMSCs 的成骨分化[103-104]。故低氧对干细胞成骨分化的影响仍需进一步研究。
组织损伤往往伴随着血供缺乏，从而导致周围环境出现氧含量不足，在外源性细胞和生物材料植入修复早期，尽管细胞会分泌血管生长因子促进新生血管形成，然而如该过程较长会导致植入细胞死亡[105]。为了改善损伤组织的极度低氧环境，目前已有学者制备出能够局部释放氧气的支架材料用于修复损伤组织。Touri 等[106]用 3D 打印技术制备出含有过氧化钙-PCL 颗粒的双相 HA/磷酸钙支架用于骨损伤修复，结果显示在缺氧条件下，该支架能够长时间（10 d）缓慢增加周围环境的氧含量，促进成骨细胞增殖。Montesdeoca 等[107]同样发现含有过氧化钙的明胶甲基丙烯酸水凝胶能够持续（6 d）释放氧气，改善缺氧条件下软骨细胞的存活率。Wang 等[108]将含有过氧化钙的明胶微球和含有 BMSCs 的海藻酸钠/明胶水凝胶复合在 3D 打印多层多孔管状 PCL/nHA 支架内部，构建细胞-支架复合物并用于修复兔股骨头坏死。体外研究结果发现该复合支架能够长时间（19 d）持续释放氧气，并且能够维持 BMSCs 在低氧环境（1%）下的增殖；体内研究结果证实与不含过氧化钙微球的支架相比，该复合支架能够提高外源性 BMSCs 的存活率，减少细胞凋亡，从而促进骨组织和血管再生。
总的来说，培养环境中的氧浓度对干细胞的命运起着非常重要的作用，然而由于目前研究缺乏统一的实验参数和干细胞种类，不同氧浓度对于干细胞的分化作用仍需要进一步研究。此外，腱骨界面不仅在细胞、结构组成以及力学性能方面具有梯度变化，细胞所处的氧环境也具有相似变化，未来研究需要同时关注肌腱和骨组织中的氧浓度，在设计相应支架时还要考虑寻找一合适氧浓度来支持相应部位细胞的成肌腱、成软骨和成骨表型。
5 力学刺激
除了组织环境中的氧浓度会影响损伤组织修复，力学刺激也会对腱骨界面组织的发育和再生起到重要作用。在生物发育阶段，力学刺激影响骨、软骨和肌腱的发育，对于骨来说，力学刺激增加（例如体力活动）会导致骨密度增加，力学刺激减少（例如石膏固定和卧床休息等）则会导致骨密度降低[109]。对于软骨和肌腱来说，力学刺激对软骨和肌腱的发育、稳态及功能至关重要，去除力学刺激会损害软骨和肌腱的结构，从而导致相应疾病发生[110-111]。部分学者通过 A 型肉毒杆菌毒素麻痹大鼠冈上肌，观察力学刺激在肩袖损伤修复中的作用，结果发现与生理盐水注射组相比，肌肉麻痹组冈上肌体积减少，界面的纤维软骨发育延迟，矿化骨也减少，同时破骨细胞活性增高，从而延缓了腱骨界面的发育[21]。显而易见，来自肌肉和肌腱的力学刺激有助于腱骨界面结构发育，从而形成具有力学性能梯度变化的结构，实现有效的力学传递和降低应力集中。
在组织工程领域，已有学者使用动态培养（例如生物反应器）方法对细胞施加不同力学刺激，来模拟人体生理器官的力学环境，诱导细胞增殖、分化以及体外形成新的组织用于修复[112]。Elashry 等[113]将 ADSCs 接种于二氧化硅/胶原纳米复合材料，并将细胞-支架复合物放入生物反应器中培养，结果发现流体剪切应力能够促进 BMSCs 的 ALP 以及成骨相关基因（Runx2）表达。除了通过生物反应器的方法使细胞感受力学刺激外，目前有学者制备出能够感受外来刺激（例如磁场或超声波），从而使自身结构发生变化的支架用于组织修复。Min 等[114]通过模板辅助电沉积和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）三肽复合技术制备出具备磁性的钴铁纳米线圈，在外来磁场作用下，纳米线圈具有“开”和“关”两种形态，体外研究结果发现纳米线圈在“开”的形态下能够促进 MSCs 黏附，并通过 Yes 相关蛋白与转录共激活因子 PDZ 结合基序（YAP/TAZ）力学传导通路促进干细胞成骨分化；体内研究结果发现在外来磁场作用下，裸鼠皮下埋植的磁性纳米线圈仍然能够促进注射在材料表面的 MSCs 黏附以及成骨相关基因（Runx2）表达。Camarero-Espinosa 等[115]使用 3D 打印技术制备了 PCL/聚乳酸混合 Janus 支架，该支架能够将外部超声产生的声学信号转换成机械纳米振动的力学信号作用于干细胞，结果发现在外来超声波作用下，Janus 支架能够促进 BMSCs 增殖、基质沉积和成骨相关基因（Runx2 和骨钙素）的表达，并且该支架是通过激活电压门控钙离子通道，从而增强 BMSCs 的成骨分化。
目前多数研究仍在探索力学刺激对于干细胞增殖、黏附、迁移和分化的影响以及相关作用机制，还未设计和制备出用于腱骨界面修复的力学刺激支架。相反，多数已设计的新型支架仅在静态细胞培养下探讨修复效果，往往忽视了力学刺激对腱骨界面愈合的影响。因此，未来研究可结合动态培养系统来控制环境中的力学刺激，从而制备具有梯度变化的材料界面，增强支架对干细胞的调控。
6 小结
近年来界面组织工程技术取得了很大进步，然而关于腱骨界面发育和再生的机制仍未探明，研究者们一直试图通过了解再生过程中所涉及的不同信号来重现界面组织的复杂性。对于种子细胞和生长因子，了解天然腱骨界面中多种细胞的相互作用尤为重要，包括细胞与细胞间的作用、细胞和 ECM 之间的作用以及旁分泌的作用。对于生物材料，可以通过多种技术手段来协同设计生物材料的特性，以模拟天然腱骨界面的微观结构、基质组成和力学特点。最后，腱骨愈合和再生的最佳策略不仅需要使用具有梯度变化的生物材料，还需要细胞、生长因子和特定培养条件（例如氧浓度和力学刺激）的结合。尽管越来越多证据表明种子细胞、生长因子和生物材料的治疗有利于腱骨界面愈合，但相应治疗手段的临床转化仍然是一个非常缓慢的过程。
作者贡献：何树坤负责资料收集和文章撰写；秦廷武负责对文章审阅和修改。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持没有影响文章观点。
