引用本文： 鲁亚杰, 王臻, 卢霄, 卢建熙, 陈献韬, 牛东升, 冯宪发, 张成泉, 余进伟, 王保苍. 生物陶瓷系统微创治疗 ARCO Ⅱ、Ⅲ期股骨头坏死. 中国修复重建外科杂志, 2019, 33(10): 1291-1298. doi: 10.7507/1002-1892.201904066 复制
股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是一种致残性疾病，好发于 20～50 岁中青年人，现已成为全球性的健康问题，在中国有超过 700 万的患病群体[1-3]。未经治疗的 ONFH，大部分患者会在 1～4 年内出现严重的髋关节功能障碍并需要行关节置换手术[4]。尽管有很多方法可以用于 ONFH 的保髋治疗，但疗效不尽如人意。关于 ONFH 的病因有很多学说，但最终的病理变化均为股骨头血运循环障碍，大量研究也证明坏死区代偿性的血管修复被硬化骨所阻隔，意味着 ONFH 无法通过机体完成自然修复，最终将导致股骨头塌陷[5-6]。
本团队既往研究证实，β 磷酸三钙（β tricalcium phosphate，β-TCP）多孔生物陶瓷具备优良的血管化性能，并探索总结出了最适于血管化的三维微结构参数：大孔直径 500～600 μm，内连接孔直径 120～160 μm[7-10]。在此基础上我们提出了采用 β-TCP 生物陶瓷系统微创治疗 ONFH 的方法，即利用多孔生物陶瓷棒将股骨大转子附近及股骨颈丰富的血运引导至坏死区，促进血管再生和骨修复。本研究通过对多孔生物陶瓷棒的血管化评价、模拟手术的力学分析，对生物陶瓷系统微创治疗 ONFH 的理论体系进行完善，并开展一项多中心临床回顾性研究，对这一新保髋方法的临床效果进行评估。报告如下。
1 多孔生物陶瓷棒血管化研究
1.1 实验动物及主要材料、试剂、仪器
7～8 月龄雄性新西兰大白兔 18 只，体质量（2.5±0.5）kg，购自空军军医大学动物实验中心。
β-TCP 多孔生物陶瓷棒（上海贝奥路生物材料有限公司），规格参数：长 12 mm，直径 5 mm，孔隙率 70%±15%，孔径 500～600 μm，大孔之间存在相互连通的内连接孔（120～160 μm）。β-TCP 多孔生物陶瓷棒的一端以生物钛膜（西安中邦钛生物材料有限公司）包裹，包裹高度 5 mm。见图 1。
图1
β-TCP 多孔生物陶瓷棒
a. 包裹生物钛膜前后大体观察；b. 扫描电镜观察（×30）
Figure1. β-TCP bioceramic roda. General observation before and after wrapping with titanium biofilm; b. Scanning electron microscope observation (×30)
MicroFill MV-117 灌注液（Flow Tech 公司，美国）；10% 中性甲醛固定液、14%EDTA 脱钙液（南昌雨露实验器材有限公司）。Leica SP1600 锯式切片机（Leica 公司，德国）；荧光显微镜（Olympus 公司，日本）；micro-CT 扫描仪（Philips 公司，荷兰）。
1.2 血管化动物模型制备
取 18 只新西兰大白兔，以陆眠宁（0.5 mL/kg）+戊巴比妥钠（30 mg/kg）复合麻醉后，于膝关节外侧作长约 1 cm 手术切口，分离软组织至骨。以电钻于兔股骨髁部制备一规则骨缺损（直径 6 mm、深 12 mm），植入包裹生物钛膜的 β-TCP 多孔生物陶瓷棒。见图 2。术后 4、8、12 周分别取 6 只动物行 MicroFill 微血管灌注：于腹正中线切开长约 8 cm 手术切口，逐层分离皮下组织及肌肉，显露腹主动脉及静脉；结扎腹主动脉及腹主静脉近心端，肝素生理盐水（100 U/L）由腹主动脉持续灌洗兔后肢血管网络，至静脉端回流液清亮；灌注 10% 中性甲醛固定液 300 mL 对后肢血管进行固定，然后采用自动注射泵灌注 50 mL MicroFill MV-117 灌注液（含稀释液及固定剂），灌注速度 10 mL/min。过量陆眠宁麻醉处死动物，尸体于 4°C 过夜后，取股骨下段标本，于 10% 中性甲醛固定液固定 72 h，然后置于 14%EDTA 脱钙液脱钙，针刺法确认脱钙成功。
图2
兔股骨髁部骨缺损模型中陶瓷棒植入位置
Figure2.
The location of bioceramic rod in rabbit model of femoral condylar bone defect
1.3 Micro-CT 扫描血管三维重建
将各时间点脱钙标本适当修剪后置于 micro-CT 扫描仪进行扫描，扫描参数：分辨率 1 024×1 024 像素，层间距 39 μm，扫描时间 20 min。将所获得的 micro-CT 图像导入三维重建分析软件 Mimics17.0（Materialise 公司，比利时），经反复调试，采用单一阈值法提取血管图像并进行三维重建。在三维模型中对血管长入包裹区深度、血管数目、血管直径进行测量。
1.4 荧光背景下血管显像
Micro-CT 扫描后将标本置于流水下冲洗 12 h，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后进行包埋。以 Leica SP1600 锯式切片机制备厚度为（300±10）μm 的硬组织切片，抛光后在荧光（激发光为蓝色光，波长 430～460 nm）背景下观察血管在骨组织中的分布及形态；在荧光背景下，骨及纤维组织为绿色，灌注后的血管显示为鲜艳的红色，二者对比度极高。各样本随机选取陶瓷棒纵轴中心位置 3 张切片，用 Image Pro Plus 6.0 软件（Media Cybernetics 公司，美国）对血管长入包裹区的深度、血管数目以及血管直径进行测量。
1.5 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。
1.6 结果
1.6.1 Micro-CT 扫描血管三维重建
术后 4 周，股骨髁部隧道周围开始出现大量修复性新生血管，由非包裹区长入包裹区内；8 周，包裹区内可见丰富的血管团簇，且骨隧道周围新生血管进一步增多并趋于成熟；12 周，新生血管几乎贯通整个包裹区，但隧道周围的新生血管相对减少。见图 3。随术后时间延长，血管长入包裹区深度、血管数目、血管直径均逐渐增加，各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
图3
植入后各时间点 micro-CT 扫描血管三维重建及陶瓷棒长轴方向 CT 图像
a. 4 周；b. 8 周；c. 12 周
Figure3. Micro-CT based three-dimensional reconstruction of blood vessel and longitudinal CT images at different time points after implantationa. Four weeks; b. Eight weeks; c. Twelve weeks
表1
术后各时间点生物钛膜包裹区血管化参数（n=6，
）
Table1.
Vascularization parameters of titanium biofilm encapsulated area at different time points after operation (n=6, 
)
1.6.2 荧光背景下血管显像
荧光背景下可见大量新生血管由陶瓷棒非包裹区长入包裹区，于 4 周和 8 周时亦可观察到骨隧道周围大量修复性血管增生。见图 4。随术后时间延长，血管长入包裹区深度、血管数目、血管直径均逐渐增加，各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
图4
植入后 8 周荧光背景下血管显像，生物钛膜（箭头） 包裹区内可见丰富血管（×12.5）
Figure4.
Fluorescence image at 8 weeks after implantation, showing rich blood vessels in the encapsulated area of biotitanium biofilm (arrow) (×12.5)
2 生物陶瓷系统治疗 ONFH 的力学研究
2.1 标本处理及主要材料、仪器
市售新鲜猪股骨 9 个，剔除所有软组织，经 X 线透视证实无病理改变；股骨头直径（37±2）mm，颈干角（120±10）°。实验前 24 h 将样本从−20℃ 取出至室温解冻，于股骨远端 1/4 处截断，留取近端 3/4 待用。
β-TCP 生物陶瓷植入物体系（上海贝奥路生物材料有限公司）包括：① 密质生物陶瓷颗粒，不规则型，粒径 1.5～3.5 mm；② 多孔生物陶瓷颗粒，不规则型，粒径 1.5～3.5 mm，孔径 500～600 μm，内连接孔直径 120～160 μm；③ 多孔生物陶瓷棒，圆柱型，直径 10 mm，长 40 mm，孔隙参数同多孔生物陶瓷颗粒。微创治疗 ONFH 配套手术器械（上海贝奥路生物材料有限公司）；Materal Test System 力学试验机（MTS 公司，美国）。
2.2 实验分组及方法
将标本随机分为 3 组：A 组为正常股骨头颈组，B 组为空腔组，C 组为植骨组，每组 3 个。按照术前标记，B、C 组于大转子下 12 mm 处沿股骨颈中心打入导针至股骨头软骨面下 5 mm，沿导针钻入空心钻形成骨隧道；然后利用潜行刮刀刮除股骨头内部分骨质，至刮刀完全展开，股骨头内部形成一球形骨缺损区（直径 28 mm）。C 组打压植入混合陶瓷颗粒（密质生物陶瓷 5 g+多孔生物陶瓷 3 g），并在骨隧道内植入 β-TCP 多孔生物陶瓷棒，骨隧道开口处以骨水泥填塞。见图 5a。
图5
生物陶瓷系统治疗 ONFH 的力学分析
a. 手术模拟建模；b. 力学加载
Figure5. Mechanical analysis of bioceramic system in the treatment of ONFHa. Simulated surgical model; b. Mechanical loading
2.3 生物力学检测
将各组股骨标本下端置于金属模具中，并用骨水泥固定于内收 15°、内旋 10° 位，矢状面位于中立位，模拟双足站立时的受力情况。力学加载采用 Materal Test System 力学试验机在股骨头顶端逐级连续加载至标本毁损，加载速度恒定为 1.0 mm/min。见图 5b。计算机记录位移和力学数据，绘制位移-形变曲线，计算各组标本的刚度及屈服载荷。
2.4 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。
2.5 结果
A、B、C 组标本的刚度分别为（2.852±0.142）、（0.807±0.171）、（1.184±0.113）kN/mm，B、C 组显著低于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、C 组间差异无统计学意义（P>0.05）。A、B、C 组屈服载荷分别为（6.765±0.142）、（1.583±0.112）、（3.121±0.531）kN，B、C 组显著低于 A 组，B 组显著低于 C 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。C 组标本的刚度恢复至 A 组的 41.52%±3.96%，屈服载荷恢复至 A 组的 46.14%±7.85%。
3 多中心回顾性临床评估
3.1 患者一般资料
纳入标准：① 国内 7 所医疗中心收治的 ONFH 患者；② 采用 β-TCP 生物陶瓷系统微创方法行保髋治疗；③ 国际骨循环协会（ARCO）分期为Ⅱ、Ⅲ期；③ 术后随访资料完整。排除标准：① 合并髋关节其他疾患；② 随访期间死亡病例。2012 年 1 月—2018 年 7 月，共 200 例（232 髋）ONFH 患者符合选择标准纳入研究。
本组男 145 例，女 55 例；年龄 17～76 岁，平均 42 岁。左髋 80 例，右髋 88 例，双髋 32 例。ONFH 原因：酒精性 91 例，激素性 58 例，创伤所致 16 例，不明原因 35 例。按照 ARCO 分期为Ⅱ期 150 髋（ⅡA 期 20 髋、ⅡB 期 60 髋、ⅡC 期 70 髋），Ⅲ期 82 髋（ⅢA 期 42 髋、ⅢB 期 22 髋、ⅢC 期 18 髋）。
3.2 手术方法
手术使用特制手术工具完成（专利：CN102038544 B）。患者于全麻或蛛网膜下腔阻滞麻醉下取仰卧位，以大转子下 20 mm 处向股骨颈中央打入导针，正侧位 X 线透视观察导针位置。以导针为中心纵行切开 12 mm 长全层切口至骨，随后钻入直径 12 mm 的空心钻至股骨头软骨下 5 mm 形成骨隧道，钻头钻入过程中收集骨泥和骨髓液；将潜行刮刀推送至骨隧道底部，顺时针旋转控刀手柄逐步展开刀片，随后顺时针转动旋刮刀柄刮除坏死骨区域。透视确认清除达标后，收拢刀片并撤出潜行刮刀；将多功能植骨器插至骨隧道底部后回撤 30 mm，打压植入混合有骨泥和骨髓液的混合生物陶瓷颗粒（密质生物陶瓷颗粒 5 g+多孔生物陶瓷颗粒 3 g），最后将浸泡过骨髓液的多孔生物陶瓷棒（直径 10 mm、长 80 mm）通过植骨器管道尽可能深地植入骨隧道，清洗和缝合切口。见图 6。
图6
手术流程示意图
a. 打入导针；b. 建立骨隧道；c. 刮除坏死骨；d. 打压植骨；e. 植入多孔生物陶瓷棒
Figure6. Surgical procedurea. Insertion of K-wire; b. Establishment of bone tunnel; c. Necrosis debridement; d. Bioceramic granule grafting;e. Implantation of the bioceramic rod
3.3 术后处理及疗效评估
患者术后次日即可免负重下床，但必须拄双拐 3 个月，随后拄单拐 3～6 个月，根据影像学结果确定负重量和时间。
术后 1、3、6 个月行影像学及肢体功能评估，随后每半年评估 1 次。影像学结果分为两个等级：① 稳定：坏死范围无扩大，无塌陷或塌陷未加重，植入材料降解并伴有成骨；② 进展：坏死范围扩大，出现塌陷或塌陷加重，植入材料未降解。术髋功能评估采用 Harris 评分，分为优（90～100 分）、良（80～90 分）、可（70～80 分）、差（<70 分）4 个等级。
3.4 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，手术前后比较采用配对 t 检验，组间比较采用独立样本 t 检验；率的比较采用 χ2 检验；检验水准 α=0.05。
3.5 结果
本组 232 髋均顺利完成手术，围术期无患者死亡。1 例患者在植入多孔生物陶瓷棒时发生肺空气栓塞，经术中对症治疗后缓解。术后均未发生感染、下肢深静脉血栓形成等并发症。200 例患者均获随访，随访时间 6～73 个月，平均 22.7 个月。
3.5.1 髋关节生存率
至末次随访时有 12 例（16 髋）行全髋关节置换术，髋关节生存率为 93.10%。3 髋因早期增加负重导致股骨头颈骨折而行全髋关节置换术，余均为 ONFH 影像学进展及临床症状持续加重而行全髋关节置换术。其中 ARCO Ⅱ期 6 髋、Ⅲ期 10 髋；Ⅱ期患者髋关节生存率为 96.00%，Ⅲ期为 87.80%，差异有统计学意义（χ2=5.545，P=0.019）。
3.5.2 影像学评估
术后即刻 X 线片可见多孔生物陶瓷棒与骨隧道之间存在间隙，植入股骨头内的陶瓷颗粒清晰且边缘锐利；术后影像学随访显示多孔生物陶瓷棒逐渐降解，伴随骨组织修复。末次随访时，184 髋（79.31%）影像学稳定，48 髋（20.69%）出现影像学进展。出现影像学进展患者中，ARCO Ⅱ期 14 髋（9.33%），Ⅲ期 34 髋（41.46%），差异有统计学意义（χ2=33.355，P=0.000）。见图 7。
图7
患者，男，38 岁，酒精性 ONFH（ARCO ⅡC 期）
a. 术前 X 线片；b. 术前 MRI；c. 术前 CT；d. 术后 1 周 X 线片；e. 术后 6 个月 X 线片；f. 术后 12 个月 X 线片；g. 术后 24 个月 X 线片
Figure7. A 38-year-old male patient with alcohol-induced ONFH (ARCO stage ⅡC)a. Preoperative X-ray film; b. Preoperative MRI; c. Preoperative CT; d. X-ray film at 1 week after operation; e. X-ray film at 6 months after operation; f. X-ray film at 12 months after operation;g. X-ray film at 24 months after operation
3.5.3 Harris 评分
本组患者末次随访时 Harris 评分为（79.3±17.3）分，较术前（57.3±12.0）分显著改善，差异有统计学意义（t=18.600，P=0.000）；获优 73 髋（31.46%），良 76 髋（32.76%），可 28 髋（12.07%），差 55 髋（23.71%），优良率达 64.22%。其中 ARCO Ⅱ期患者末次随访时 Harris 评分为（84.6±14.5）分，显著高于Ⅲ期的（69.7±18.1）分，差异有统计学意义（t=6.871，P=0.000）。
4 讨论
4.1 多孔生物陶瓷微创治疗 ONFH 的理论体系
β-TCP 多孔生物陶瓷具有生物相容性、骨传导性及生物降解性等优点，作为人工骨材料已被广泛用于骨缺损修复等领域。其代谢产物主要为 Ca2+ 和 PO43-，可直接参与骨的矿化，促进新骨形成。我们既往研究也证实了特定三维结构的 β-TCP 多孔生物陶瓷具备引导血管再生的性能，并确定了利于血管化的最佳三维结构参数[7, 9]。生物陶瓷系统微创治疗 ONFH，通过清除死骨、重建骨床及多孔生物陶瓷材料的血管引导作用，重建骨坏死区的血运，使其最终形成生物性骨修复及生物性力学支撑。其核心理论体系包括 5 个方面：① 多孔生物陶瓷棒发挥“桥梁”作用，将大转子附近及股骨颈丰富的血运循环引导至股骨头，为坏死区修复提供干细胞及营养物质，创造基本修复条件；② 通过特制的潜行刮刀对股骨头内坏死组织进行清除，然后混合术程中收集的骨泥及骨髓液，增强了生物陶瓷的生物活性及修复性能；③ 通过粗通道髓芯减压释放骨内高压，可缓解患者疼痛症状，利于坏死修复；④ 股骨头内植骨采用密质生物陶瓷和多孔生物陶瓷混合打压的方式，可在术后早期为软骨下骨提供一定的力学支撑，同时不至于破坏多孔生物陶瓷颗粒的互联互通结构而影响其血管化及成骨性能；⑤ 随着生物陶瓷降解及新骨生成，股骨头颈的生物力学性能逐步增强，最终可恢复完全的骨性力学支撑。
本研究利用动物实验，通过 micro-CT 血管三维重建及荧光背景显像的方法确证了多孔生物陶瓷棒的血管化能力。用生物钛膜包裹部分多孔生物陶瓷棒，模拟体内缺血环境，血管及骨修复只能经由陶瓷棒单向进行。结果显示，在早期修复过程中，陶瓷棒周围出现大量代偿性新生血管，并且在 12 周时，陶瓷棒内新生血管贯通钛膜包裹区。结合临床，粗通道髓芯减压及病灶刮除所致创伤，在术后早期可动员大量新生血管，为 ONFH 的修复提供了基础血运条件。大转子附近及股骨颈的血运在术后即刻通过血流灌注的方式到达坏死区，后期随着新生血管逐步长入，可于陶瓷系统内部形成稳定的动静脉循环系统，恢复股骨头内血运。模拟手术的力学检测结果显示，潜行刮刀经由股骨颈粗通道对股骨头内病灶进行刮除，会导致股骨头颈部力学性能明显下降，其刚度下降至正常骨的 28.31%±6.00%，屈服载荷下降至正常骨的 23.40%±1.66%。进行混合打压植骨及陶瓷棒植入，可以部分恢复股骨头颈部力学性能，其刚度恢复至正常骨的 41.52%±3.96%，屈服载荷恢复至正常骨的 46.14%±7.85%。与其他保髋方法不同的是，随着植入生物陶瓷的降解和新骨形成，股骨头颈部的生物力学性能逐步增强，理论上最终可形成与正常骨同样的力学支撑。
4.2 临床疗效及其相关影响因素
多中心临床回顾性研究结果显示，本组患者髋关节总生存率为 93.10%。其他研究报道中，经髓芯减压通道或股骨颈窗的非血管化骨移植，其髋关节生存率为 55%～87%[11-13]；钽棒植入的髋关节生存率为 60%～80%，但有一些学者对此数据提出质疑，并不推荐将钽棒植入作为首选[14-16]；血管化移植包括血管化腓骨移植及血管化骨瓣转移，其髋关节生存率超过 80%[17-19]。β-TCP 生物陶瓷系统微创治疗 ONFH，其髋关节生存率优于非血管化骨移植及钽棒植入，接近血管化骨移植效果。该方法的优势在于：① 恢复股骨头血运，从基础理论上解决股骨头修复的血供问题；② 植入生物陶瓷材料可降解，不影响 X 线片、CT 及 MRI 等影像学检查，若保髋失败，不影响关节置换；③ 力学支撑逐步增强；④ 手术微创，操作步骤简便易行，适于推广。本组末次随访时患者 Harris 评分为（79.3±17.3）分，优良率达 64.22%。按照术前 ARCO 分期对患者进行分组分析，结果显示 ARCO Ⅱ期患者髋关节生存率、影像学等级及 Harris 评分均显著优于 ARCO Ⅲ期患者（P<0.05）。提示 ONFH 术前分期对手术预后具有重要影响，术前股骨头塌陷、软骨下骨分离以及软骨剥脱，常常提示预后不良。
综上述，生物陶瓷系统微创治疗 ONFH，可引导大转子附近及股骨颈血运至股骨头促进坏死修复，早期能够部分恢复股骨头颈力学性能，为 ONFH 患者，尤其是早期坏死患者提供了一种新的微创保髋方法。但本研究存在以下局限性，有待进一步完善：① 血管化研究中使用 5 mm×12 mm 规格小陶瓷棒，与临床有所区别；② 难以获得足够样本的新鲜人股骨进行力学模拟，猪股骨头颈部解剖学参数虽与人相近，但存在一定差异；③ 由于该方法应用时间较短，缺乏长期随访结果，因此临床评估有待进一步跟进，目前相关的临床多中心前瞻性研究已经启动。
作者贡献：鲁亚杰、卢霄负责统计分析，文章撰写；王臻、卢建熙负责科研设计；鲁亚杰、陈献韬、牛东升、冯宪发、张成泉、余进伟、王保苍负责科研实施和数据收集整理。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。
机构伦理问题：多中心临床研究方案经中国人民解放军空军军医大学第一附属医院药物临床试验伦理委员会批准（KY20162052-1）。动物实验经中国人民解放军空军军医大学实验动物伦理委员会批准，实验动物使用许可证号：SYXK（陕）2014-001。
股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是一种致残性疾病，好发于 20～50 岁中青年人，现已成为全球性的健康问题，在中国有超过 700 万的患病群体[1-3]。未经治疗的 ONFH，大部分患者会在 1～4 年内出现严重的髋关节功能障碍并需要行关节置换手术[4]。尽管有很多方法可以用于 ONFH 的保髋治疗，但疗效不尽如人意。关于 ONFH 的病因有很多学说，但最终的病理变化均为股骨头血运循环障碍，大量研究也证明坏死区代偿性的血管修复被硬化骨所阻隔，意味着 ONFH 无法通过机体完成自然修复，最终将导致股骨头塌陷[5-6]。
本团队既往研究证实，β 磷酸三钙（β tricalcium phosphate，β-TCP）多孔生物陶瓷具备优良的血管化性能，并探索总结出了最适于血管化的三维微结构参数：大孔直径 500～600 μm，内连接孔直径 120～160 μm[7-10]。在此基础上我们提出了采用 β-TCP 生物陶瓷系统微创治疗 ONFH 的方法，即利用多孔生物陶瓷棒将股骨大转子附近及股骨颈丰富的血运引导至坏死区，促进血管再生和骨修复。本研究通过对多孔生物陶瓷棒的血管化评价、模拟手术的力学分析，对生物陶瓷系统微创治疗 ONFH 的理论体系进行完善，并开展一项多中心临床回顾性研究，对这一新保髋方法的临床效果进行评估。报告如下。
1 多孔生物陶瓷棒血管化研究
1.1 实验动物及主要材料、试剂、仪器
7～8 月龄雄性新西兰大白兔 18 只，体质量（2.5±0.5）kg，购自空军军医大学动物实验中心。
β-TCP 多孔生物陶瓷棒（上海贝奥路生物材料有限公司），规格参数：长 12 mm，直径 5 mm，孔隙率 70%±15%，孔径 500～600 μm，大孔之间存在相互连通的内连接孔（120～160 μm）。β-TCP 多孔生物陶瓷棒的一端以生物钛膜（西安中邦钛生物材料有限公司）包裹，包裹高度 5 mm。见图 1。
图1
β-TCP 多孔生物陶瓷棒
a. 包裹生物钛膜前后大体观察；b. 扫描电镜观察（×30）
Figure1. β-TCP bioceramic roda. General observation before and after wrapping with titanium biofilm; b. Scanning electron microscope observation (×30)
MicroFill MV-117 灌注液（Flow Tech 公司，美国）；10% 中性甲醛固定液、14%EDTA 脱钙液（南昌雨露实验器材有限公司）。Leica SP1600 锯式切片机（Leica 公司，德国）；荧光显微镜（Olympus 公司，日本）；micro-CT 扫描仪（Philips 公司，荷兰）。
1.2 血管化动物模型制备
取 18 只新西兰大白兔，以陆眠宁（0.5 mL/kg）+戊巴比妥钠（30 mg/kg）复合麻醉后，于膝关节外侧作长约 1 cm 手术切口，分离软组织至骨。以电钻于兔股骨髁部制备一规则骨缺损（直径 6 mm、深 12 mm），植入包裹生物钛膜的 β-TCP 多孔生物陶瓷棒。见图 2。术后 4、8、12 周分别取 6 只动物行 MicroFill 微血管灌注：于腹正中线切开长约 8 cm 手术切口，逐层分离皮下组织及肌肉，显露腹主动脉及静脉；结扎腹主动脉及腹主静脉近心端，肝素生理盐水（100 U/L）由腹主动脉持续灌洗兔后肢血管网络，至静脉端回流液清亮；灌注 10% 中性甲醛固定液 300 mL 对后肢血管进行固定，然后采用自动注射泵灌注 50 mL MicroFill MV-117 灌注液（含稀释液及固定剂），灌注速度 10 mL/min。过量陆眠宁麻醉处死动物，尸体于 4°C 过夜后，取股骨下段标本，于 10% 中性甲醛固定液固定 72 h，然后置于 14%EDTA 脱钙液脱钙，针刺法确认脱钙成功。
图2
兔股骨髁部骨缺损模型中陶瓷棒植入位置
Figure2.
The location of bioceramic rod in rabbit model of femoral condylar bone defect
1.3 Micro-CT 扫描血管三维重建
将各时间点脱钙标本适当修剪后置于 micro-CT 扫描仪进行扫描，扫描参数：分辨率 1 024×1 024 像素，层间距 39 μm，扫描时间 20 min。将所获得的 micro-CT 图像导入三维重建分析软件 Mimics17.0（Materialise 公司，比利时），经反复调试，采用单一阈值法提取血管图像并进行三维重建。在三维模型中对血管长入包裹区深度、血管数目、血管直径进行测量。
1.4 荧光背景下血管显像
Micro-CT 扫描后将标本置于流水下冲洗 12 h，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后进行包埋。以 Leica SP1600 锯式切片机制备厚度为（300±10）μm 的硬组织切片，抛光后在荧光（激发光为蓝色光，波长 430～460 nm）背景下观察血管在骨组织中的分布及形态；在荧光背景下，骨及纤维组织为绿色，灌注后的血管显示为鲜艳的红色，二者对比度极高。各样本随机选取陶瓷棒纵轴中心位置 3 张切片，用 Image Pro Plus 6.0 软件（Media Cybernetics 公司，美国）对血管长入包裹区的深度、血管数目以及血管直径进行测量。
1.5 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。
1.6 结果
1.6.1 Micro-CT 扫描血管三维重建
术后 4 周，股骨髁部隧道周围开始出现大量修复性新生血管，由非包裹区长入包裹区内；8 周，包裹区内可见丰富的血管团簇，且骨隧道周围新生血管进一步增多并趋于成熟；12 周，新生血管几乎贯通整个包裹区，但隧道周围的新生血管相对减少。见图 3。随术后时间延长，血管长入包裹区深度、血管数目、血管直径均逐渐增加，各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
图3
植入后各时间点 micro-CT 扫描血管三维重建及陶瓷棒长轴方向 CT 图像
a. 4 周；b. 8 周；c. 12 周
Figure3. Micro-CT based three-dimensional reconstruction of blood vessel and longitudinal CT images at different time points after implantationa. Four weeks; b. Eight weeks; c. Twelve weeks
表1
术后各时间点生物钛膜包裹区血管化参数（n=6，）
Table1.
Vascularization parameters of titanium biofilm encapsulated area at different time points after operation (n=6, )
1.6.2 荧光背景下血管显像
荧光背景下可见大量新生血管由陶瓷棒非包裹区长入包裹区，于 4 周和 8 周时亦可观察到骨隧道周围大量修复性血管增生。见图 4。随术后时间延长，血管长入包裹区深度、血管数目、血管直径均逐渐增加，各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
图4
植入后 8 周荧光背景下血管显像，生物钛膜（箭头） 包裹区内可见丰富血管（×12.5）
Figure4.
Fluorescence image at 8 weeks after implantation, showing rich blood vessels in the encapsulated area of biotitanium biofilm (arrow) (×12.5)
2 生物陶瓷系统治疗 ONFH 的力学研究
2.1 标本处理及主要材料、仪器
市售新鲜猪股骨 9 个，剔除所有软组织，经 X 线透视证实无病理改变；股骨头直径（37±2）mm，颈干角（120±10）°。实验前 24 h 将样本从−20℃ 取出至室温解冻，于股骨远端 1/4 处截断，留取近端 3/4 待用。
β-TCP 生物陶瓷植入物体系（上海贝奥路生物材料有限公司）包括：① 密质生物陶瓷颗粒，不规则型，粒径 1.5～3.5 mm；② 多孔生物陶瓷颗粒，不规则型，粒径 1.5～3.5 mm，孔径 500～600 μm，内连接孔直径 120～160 μm；③ 多孔生物陶瓷棒，圆柱型，直径 10 mm，长 40 mm，孔隙参数同多孔生物陶瓷颗粒。微创治疗 ONFH 配套手术器械（上海贝奥路生物材料有限公司）；Materal Test System 力学试验机（MTS 公司，美国）。
2.2 实验分组及方法
将标本随机分为 3 组：A 组为正常股骨头颈组，B 组为空腔组，C 组为植骨组，每组 3 个。按照术前标记，B、C 组于大转子下 12 mm 处沿股骨颈中心打入导针至股骨头软骨面下 5 mm，沿导针钻入空心钻形成骨隧道；然后利用潜行刮刀刮除股骨头内部分骨质，至刮刀完全展开，股骨头内部形成一球形骨缺损区（直径 28 mm）。C 组打压植入混合陶瓷颗粒（密质生物陶瓷 5 g+多孔生物陶瓷 3 g），并在骨隧道内植入 β-TCP 多孔生物陶瓷棒，骨隧道开口处以骨水泥填塞。见图 5a。
图5
生物陶瓷系统治疗 ONFH 的力学分析
a. 手术模拟建模；b. 力学加载
Figure5. Mechanical analysis of bioceramic system in the treatment of ONFHa. Simulated surgical model; b. Mechanical loading
2.3 生物力学检测
将各组股骨标本下端置于金属模具中，并用骨水泥固定于内收 15°、内旋 10° 位，矢状面位于中立位，模拟双足站立时的受力情况。力学加载采用 Materal Test System 力学试验机在股骨头顶端逐级连续加载至标本毁损，加载速度恒定为 1.0 mm/min。见图 5b。计算机记录位移和力学数据，绘制位移-形变曲线，计算各组标本的刚度及屈服载荷。
2.4 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。
2.5 结果
A、B、C 组标本的刚度分别为（2.852±0.142）、（0.807±0.171）、（1.184±0.113）kN/mm，B、C 组显著低于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、C 组间差异无统计学意义（P>0.05）。A、B、C 组屈服载荷分别为（6.765±0.142）、（1.583±0.112）、（3.121±0.531）kN，B、C 组显著低于 A 组，B 组显著低于 C 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。C 组标本的刚度恢复至 A 组的 41.52%±3.96%，屈服载荷恢复至 A 组的 46.14%±7.85%。
3 多中心回顾性临床评估
3.1 患者一般资料
纳入标准：① 国内 7 所医疗中心收治的 ONFH 患者；② 采用 β-TCP 生物陶瓷系统微创方法行保髋治疗；③ 国际骨循环协会（ARCO）分期为Ⅱ、Ⅲ期；③ 术后随访资料完整。排除标准：① 合并髋关节其他疾患；② 随访期间死亡病例。2012 年 1 月—2018 年 7 月，共 200 例（232 髋）ONFH 患者符合选择标准纳入研究。
本组男 145 例，女 55 例；年龄 17～76 岁，平均 42 岁。左髋 80 例，右髋 88 例，双髋 32 例。ONFH 原因：酒精性 91 例，激素性 58 例，创伤所致 16 例，不明原因 35 例。按照 ARCO 分期为Ⅱ期 150 髋（ⅡA 期 20 髋、ⅡB 期 60 髋、ⅡC 期 70 髋），Ⅲ期 82 髋（ⅢA 期 42 髋、ⅢB 期 22 髋、ⅢC 期 18 髋）。
3.2 手术方法
手术使用特制手术工具完成（专利：CN102038544 B）。患者于全麻或蛛网膜下腔阻滞麻醉下取仰卧位，以大转子下 20 mm 处向股骨颈中央打入导针，正侧位 X 线透视观察导针位置。以导针为中心纵行切开 12 mm 长全层切口至骨，随后钻入直径 12 mm 的空心钻至股骨头软骨下 5 mm 形成骨隧道，钻头钻入过程中收集骨泥和骨髓液；将潜行刮刀推送至骨隧道底部，顺时针旋转控刀手柄逐步展开刀片，随后顺时针转动旋刮刀柄刮除坏死骨区域。透视确认清除达标后，收拢刀片并撤出潜行刮刀；将多功能植骨器插至骨隧道底部后回撤 30 mm，打压植入混合有骨泥和骨髓液的混合生物陶瓷颗粒（密质生物陶瓷颗粒 5 g+多孔生物陶瓷颗粒 3 g），最后将浸泡过骨髓液的多孔生物陶瓷棒（直径 10 mm、长 80 mm）通过植骨器管道尽可能深地植入骨隧道，清洗和缝合切口。见图 6。
图6
手术流程示意图
a. 打入导针；b. 建立骨隧道；c. 刮除坏死骨；d. 打压植骨；e. 植入多孔生物陶瓷棒
Figure6. Surgical procedurea. Insertion of K-wire; b. Establishment of bone tunnel; c. Necrosis debridement; d. Bioceramic granule grafting;e. Implantation of the bioceramic rod
3.3 术后处理及疗效评估
患者术后次日即可免负重下床，但必须拄双拐 3 个月，随后拄单拐 3～6 个月，根据影像学结果确定负重量和时间。
术后 1、3、6 个月行影像学及肢体功能评估，随后每半年评估 1 次。影像学结果分为两个等级：① 稳定：坏死范围无扩大，无塌陷或塌陷未加重，植入材料降解并伴有成骨；② 进展：坏死范围扩大，出现塌陷或塌陷加重，植入材料未降解。术髋功能评估采用 Harris 评分，分为优（90～100 分）、良（80～90 分）、可（70～80 分）、差（<70 分）4 个等级。
3.4 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，手术前后比较采用配对 t 检验，组间比较采用独立样本 t 检验；率的比较采用 χ2 检验；检验水准 α=0.05。
3.5 结果
本组 232 髋均顺利完成手术，围术期无患者死亡。1 例患者在植入多孔生物陶瓷棒时发生肺空气栓塞，经术中对症治疗后缓解。术后均未发生感染、下肢深静脉血栓形成等并发症。200 例患者均获随访，随访时间 6～73 个月，平均 22.7 个月。
3.5.1 髋关节生存率
至末次随访时有 12 例（16 髋）行全髋关节置换术，髋关节生存率为 93.10%。3 髋因早期增加负重导致股骨头颈骨折而行全髋关节置换术，余均为 ONFH 影像学进展及临床症状持续加重而行全髋关节置换术。其中 ARCO Ⅱ期 6 髋、Ⅲ期 10 髋；Ⅱ期患者髋关节生存率为 96.00%，Ⅲ期为 87.80%，差异有统计学意义（χ2=5.545，P=0.019）。
3.5.2 影像学评估
术后即刻 X 线片可见多孔生物陶瓷棒与骨隧道之间存在间隙，植入股骨头内的陶瓷颗粒清晰且边缘锐利；术后影像学随访显示多孔生物陶瓷棒逐渐降解，伴随骨组织修复。末次随访时，184 髋（79.31%）影像学稳定，48 髋（20.69%）出现影像学进展。出现影像学进展患者中，ARCO Ⅱ期 14 髋（9.33%），Ⅲ期 34 髋（41.46%），差异有统计学意义（χ2=33.355，P=0.000）。见图 7。
图7
患者，男，38 岁，酒精性 ONFH（ARCO ⅡC 期）
a. 术前 X 线片；b. 术前 MRI；c. 术前 CT；d. 术后 1 周 X 线片；e. 术后 6 个月 X 线片；f. 术后 12 个月 X 线片；g. 术后 24 个月 X 线片
Figure7. A 38-year-old male patient with alcohol-induced ONFH (ARCO stage ⅡC)a. Preoperative X-ray film; b. Preoperative MRI; c. Preoperative CT; d. X-ray film at 1 week after operation; e. X-ray film at 6 months after operation; f. X-ray film at 12 months after operation;g. X-ray film at 24 months after operation
3.5.3 Harris 评分
本组患者末次随访时 Harris 评分为（79.3±17.3）分，较术前（57.3±12.0）分显著改善，差异有统计学意义（t=18.600，P=0.000）；获优 73 髋（31.46%），良 76 髋（32.76%），可 28 髋（12.07%），差 55 髋（23.71%），优良率达 64.22%。其中 ARCO Ⅱ期患者末次随访时 Harris 评分为（84.6±14.5）分，显著高于Ⅲ期的（69.7±18.1）分，差异有统计学意义（t=6.871，P=0.000）。
4 讨论
4.1 多孔生物陶瓷微创治疗 ONFH 的理论体系
β-TCP 多孔生物陶瓷具有生物相容性、骨传导性及生物降解性等优点，作为人工骨材料已被广泛用于骨缺损修复等领域。其代谢产物主要为 Ca2+ 和 PO43-，可直接参与骨的矿化，促进新骨形成。我们既往研究也证实了特定三维结构的 β-TCP 多孔生物陶瓷具备引导血管再生的性能，并确定了利于血管化的最佳三维结构参数[7, 9]。生物陶瓷系统微创治疗 ONFH，通过清除死骨、重建骨床及多孔生物陶瓷材料的血管引导作用，重建骨坏死区的血运，使其最终形成生物性骨修复及生物性力学支撑。其核心理论体系包括 5 个方面：① 多孔生物陶瓷棒发挥“桥梁”作用，将大转子附近及股骨颈丰富的血运循环引导至股骨头，为坏死区修复提供干细胞及营养物质，创造基本修复条件；② 通过特制的潜行刮刀对股骨头内坏死组织进行清除，然后混合术程中收集的骨泥及骨髓液，增强了生物陶瓷的生物活性及修复性能；③ 通过粗通道髓芯减压释放骨内高压，可缓解患者疼痛症状，利于坏死修复；④ 股骨头内植骨采用密质生物陶瓷和多孔生物陶瓷混合打压的方式，可在术后早期为软骨下骨提供一定的力学支撑，同时不至于破坏多孔生物陶瓷颗粒的互联互通结构而影响其血管化及成骨性能；⑤ 随着生物陶瓷降解及新骨生成，股骨头颈的生物力学性能逐步增强，最终可恢复完全的骨性力学支撑。
本研究利用动物实验，通过 micro-CT 血管三维重建及荧光背景显像的方法确证了多孔生物陶瓷棒的血管化能力。用生物钛膜包裹部分多孔生物陶瓷棒，模拟体内缺血环境，血管及骨修复只能经由陶瓷棒单向进行。结果显示，在早期修复过程中，陶瓷棒周围出现大量代偿性新生血管，并且在 12 周时，陶瓷棒内新生血管贯通钛膜包裹区。结合临床，粗通道髓芯减压及病灶刮除所致创伤，在术后早期可动员大量新生血管，为 ONFH 的修复提供了基础血运条件。大转子附近及股骨颈的血运在术后即刻通过血流灌注的方式到达坏死区，后期随着新生血管逐步长入，可于陶瓷系统内部形成稳定的动静脉循环系统，恢复股骨头内血运。模拟手术的力学检测结果显示，潜行刮刀经由股骨颈粗通道对股骨头内病灶进行刮除，会导致股骨头颈部力学性能明显下降，其刚度下降至正常骨的 28.31%±6.00%，屈服载荷下降至正常骨的 23.40%±1.66%。进行混合打压植骨及陶瓷棒植入，可以部分恢复股骨头颈部力学性能，其刚度恢复至正常骨的 41.52%±3.96%，屈服载荷恢复至正常骨的 46.14%±7.85%。与其他保髋方法不同的是，随着植入生物陶瓷的降解和新骨形成，股骨头颈部的生物力学性能逐步增强，理论上最终可形成与正常骨同样的力学支撑。
4.2 临床疗效及其相关影响因素
多中心临床回顾性研究结果显示，本组患者髋关节总生存率为 93.10%。其他研究报道中，经髓芯减压通道或股骨颈窗的非血管化骨移植，其髋关节生存率为 55%～87%[11-13]；钽棒植入的髋关节生存率为 60%～80%，但有一些学者对此数据提出质疑，并不推荐将钽棒植入作为首选[14-16]；血管化移植包括血管化腓骨移植及血管化骨瓣转移，其髋关节生存率超过 80%[17-19]。β-TCP 生物陶瓷系统微创治疗 ONFH，其髋关节生存率优于非血管化骨移植及钽棒植入，接近血管化骨移植效果。该方法的优势在于：① 恢复股骨头血运，从基础理论上解决股骨头修复的血供问题；② 植入生物陶瓷材料可降解，不影响 X 线片、CT 及 MRI 等影像学检查，若保髋失败，不影响关节置换；③ 力学支撑逐步增强；④ 手术微创，操作步骤简便易行，适于推广。本组末次随访时患者 Harris 评分为（79.3±17.3）分，优良率达 64.22%。按照术前 ARCO 分期对患者进行分组分析，结果显示 ARCO Ⅱ期患者髋关节生存率、影像学等级及 Harris 评分均显著优于 ARCO Ⅲ期患者（P<0.05）。提示 ONFH 术前分期对手术预后具有重要影响，术前股骨头塌陷、软骨下骨分离以及软骨剥脱，常常提示预后不良。
综上述，生物陶瓷系统微创治疗 ONFH，可引导大转子附近及股骨颈血运至股骨头促进坏死修复，早期能够部分恢复股骨头颈力学性能，为 ONFH 患者，尤其是早期坏死患者提供了一种新的微创保髋方法。但本研究存在以下局限性，有待进一步完善：① 血管化研究中使用 5 mm×12 mm 规格小陶瓷棒，与临床有所区别；② 难以获得足够样本的新鲜人股骨进行力学模拟，猪股骨头颈部解剖学参数虽与人相近，但存在一定差异；③ 由于该方法应用时间较短，缺乏长期随访结果，因此临床评估有待进一步跟进，目前相关的临床多中心前瞻性研究已经启动。
作者贡献：鲁亚杰、卢霄负责统计分析，文章撰写；王臻、卢建熙负责科研设计；鲁亚杰、陈献韬、牛东升、冯宪发、张成泉、余进伟、王保苍负责科研实施和数据收集整理。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。
机构伦理问题：多中心临床研究方案经中国人民解放军空军军医大学第一附属医院药物临床试验伦理委员会批准（KY20162052-1）。动物实验经中国人民解放军空军军医大学实验动物伦理委员会批准，实验动物使用许可证号：SYXK（陕）2014-001。
