引用本文： 李雪梅, 张雨诗, 钟科, 芦帅, 陈跃. 改良型富血小板纤维蛋白与 β-磷酸三钙复合物诱导骨再生的研究. 中国修复重建外科杂志, 2019, 33(2): 177-184. doi: 10.7507/1002-1892.201807002 复制
临床常见牙周病、龋病、外伤、肿瘤切除等原因引起的牙列缺损或缺失，由于通常伴不同程度牙槽骨骨量不足，临床种植修复困难。引导骨组织再生术是牙槽骨骨增量技术的重要手段。随着骨组织工程研究的发展，通过结合生长因子与支架材料来诱导骨再生为骨缺损修复提供了新途径。富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是临床骨缺损治疗中常用的自体生长因子供体，所含的生长因子如 TGF-β1、VEGF 等，可持续释放达 7 d[1]。2014 年，Ghanaati 等[2]提出了改良型 PRF（advanced-PRF，A-PRF），其释放生长因子更多、持续时间更长[3-4]。β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）作为骨组织工程常用的支架材料，具有骨引导作用，常与各种具有骨诱导作用的生长因子复合使用。Siddiqui 等[5]将 PRF 与 β-TCP 复合成功用于临床Ⅱ度根分叉病变的治疗。Yilmaz 等[6]发现 β-TCP 与 PRF 复合修复猪胫骨缺损效果优于单纯的 PRF、β-TCP 修复。目前，关于 A-PRF 与 β-TCP 复合物对骨缺损修复作用的研究报道较少。为此，本实验通过构建不同比例的新西兰兔 A-PRF 及 β-TCP 复合物，并修复兔股骨髁骨缺损，探讨 A-PRF 及 β-TCP 复合物修复骨缺损效果并筛选最佳比例，为临床应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6～9 月龄雌性新西兰兔 32 只，体质量 2.5～3.0 kg，由成都达硕实验动物有限公司提供，使用许可证号 SYXK（川）2014-189。实验通过西南医科大学动物实验伦理委员会批准。
β-TCP（OSferion；奥林巴斯泰尔茂生物材料株式会社，日本）；吉特瑞医用胶原修复膜（福建省博特生物科技有限公司）；PRF 工具盒（Process, Nice 公司，法国）；离心机（TDZ4-WS，长沙湘仪集团有限公司）；牙片机（KAVO 公司，德国）；小动物活体断层扫描仪（Micro-CT）、分析软件 Feldkamp（SIEMENS 公司，德国）；生物力学测试系统［协强仪器制造（上海）有限公司］。
1.2 实验分组及方法
1.2.1 分组方法
将 32 只新西兰兔随机分为 6 组，其中 A、B、C、D、E 组为不同比例（1∶1、2∶1、4∶1、1∶2、1∶4，V/V）APRF 与 β-TCP 复合物修复股骨髁骨缺损组，每组各 6 只；F 组（2 只）为空白对照组。
1.2.2 A-PRF 制备
参照本课题组前期实验结果制备 A-PRF[7]。采集各组兔耳中动脉血，于 25℃、以离心半径 12 cm、2 000 r/min 离心 24 min；室温下静置 1 min。离心管上层为无细胞血浆层，中间层为 A-PRF 凝胶，底部为红细胞层。取出 A-PRF 凝胶，置于 PRF 工具盒内剪碎，备用。
1.2.3 动物模型制备及实验方法
取各组动物首先制备股骨髁骨缺损模型。耳缘静脉注射 3% 戊巴比妥溶液（1 mL/kg）麻醉后，自双后肢膝关节外侧距前缘 1.0～1.5 cm 处，平行前缘作一长约 5 cm 弧形切口；逐层分离暴露股骨外侧髁解剖标志，用环形中空取骨钻制备直径 6 mm、深 8 mm 的圆柱形骨缺损[8-12]。于距离骨缺损中央 6 mm 处，左右对称各旋入 1 枚直径 2 mm 的钛钉定位。A～E 组按照 1∶1、2∶1、4∶1、1∶2、1∶4（V/V）比例配置 A-PRF 与 β-TCP 复合物，复合物总量为 0.5 mL，混合均匀。将复合物充填骨缺损，医用胶原修复膜覆盖。见图 1。F 组制备骨缺损后不填充材料，仅用医用胶原修复膜覆盖骨缺损表面。术后 3 d 内每天肌肉注射青霉素钠 80 万 U。术后 8、12 周，A～E 组各取 3 只、F 组各取 1 只动物，耳缘静脉注射过量麻药处死后，取材进行以下观测。
图1
兔股骨髁骨缺损修复模型制备步骤
a. 暴露股骨髁；b. 制备骨缺损；c. 钛钉定位；d. 植入 A-PRF 与 β-TCP 复合物；e. 覆盖医用胶原修复膜
Figure1. The preparation of bone defect and repair model in rabbit femoral condylea. Exposing femur condyle; b. Preparing bone defect; c. Positioning of titanium nail; d. Implanting the A-PRF and β-TCP composite; e. Covering the defect with medical collagen repair membranes
1.3 观测指标
1.3.1 大体观察
各时间点，按照原手术切口入路，逐层分离双后肢股骨髁骨区皮肤和软组织，观察骨缺损表面愈合情况。
1.3.2 X 线片观察
大体观察后，行双后肢股骨髁骨区 X 线片检查，观察骨缺损愈合情况。
1.3.3 Micro-CT 观测
X 线片观察后，双后肢股骨髁骨区行 Micro-CT 扫描，观察新生骨形成情况。扫描条件：扫描高度 1.5 cm，层距 19 μm，跨越 780～800 层，曝光时间 1 800 ms，管电压 80 kV，管电流 500 μA。将获取的 A～E 组 Micro-CT 图像采用 Feldkamp 分析软件进行重建分析，从上至下在距离股骨髁外侧面 2 mm 与 5 mm 处分别取横断面，获得 3 段新生骨区，设定新生骨阈值 500～1 500，β-TCP 颗粒阈值 1 500 以上[13]，测量新生骨相关指标，包括骨体积/组织体积（bone volume/ total volume，BV/TV）、骨小梁数目（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁间隙（trabecular spacing，Tb.Sp）。3 段新生骨区各检测指标取均值。
1.3.4 生物力学测试
Micro-CT 检测后取 A～E 组新生骨组织，修整为高 8 mm、直径 5 mm 的圆柱形。采用生物力学测试系统进行检测，加载速率设定 1 mm/min，沿标本长轴方向加压，期间用生理盐水湿润，直至骨标本破裂骨折后停止加载，计算材料压缩强度和弹性模量。
1.4 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；组内不同时间点间比较采用配对 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 大体观察
术后 8 周，A～E 组骨缺损区均可见新生骨，其中 B 组表面凹陷程度最轻，E 组骨表面凹陷较明显且可见少量 β-TCP 残留；F 组可见纤维肉芽组织充填且骨缺损边界明显。12 周时，A～E 组骨表面仍有轻微凹陷，但较 8 周时凹陷程度轻；骨缺损区新生骨边缘移行不清，尤其 B 组最显著；F 组骨缺损边界内侧见少量骨痂，未见明显新骨生成。各组术后 12 周表面骨质形成均优于 8 周。见图 2。
图2
各组大体观察
从上至下分别为 A、B、C、D、E、F 组a. 术后 8 周；b. 术后 12 周
Figure2. Gross observation of each groupFrom top to bottom for groups A, B, C, D, E, and F, respectively a. At 8 weeks after operation; b. At 12 weeks after operation
2.2 X 线片观察
术后 8 周，F 组低密度骨缺损范围最大且边界清晰，其次为 C、A、D、E 组，B 组骨缺损范围最小。12 周时，F 组缺损范围最大但边界呈雾化状，其次为 C、D、E、A 组范围较小，B 组最小且见较高密度区域移行与周围骨融合；新生骨呈向心性生长；A～E 组低密度骨缺损范围与 8 周时相比，由边缘向中央逐渐减小，且骨密度增高。见图 3。
图3
各组 X 线片观察
从上至下分别为 A、B、C、D、E、F 组a. 术后 8 周；b. 术后 12 周
Figure3. X-ray films of each groupFrom top to bottom for groups A, B, C, D, E, and F, respectively a. At 8 weeks after operation; b. At 12 weeks after operation
2.3 Micro-CT 观测
术后 8 周，A～E 组均可见较清晰排列的骨小梁且骨小梁间髓腔较大；其中 B 组新生骨骨小梁最多，呈条索状或板层状，排列紧密；C 组新生骨小梁最少，呈条状，连续性欠佳，骨小梁间间隙大。12 周时，A～E 组骨小梁均较 8 周时明显增多，排列密集交错，骨小梁间髓腔宽度明显减小，B 组最小，A、C、D、E 组相近。见图 4。
图4
各组 Micro-CT 观察
从上至下分别为 A、B、C、D、E、F 组a. 术后 8 周；b. 术后 12 周
Figure4. Micro-CT observation of each groupFrom top to bottom for groups A, B, C, D, E, and F, respectively a. At 8 weeks after operation; b. At 12 weeks after operation
术后 8 周：① BV/TV，B、D 组与 A、C、E 组比较，B、D 组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。② Tb.N，B、C、E 组与 A、D 组比较以及 B、C、E 组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。③ Tb.Th，组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。④ Tb.Sp，B 组与 D 组比较以及 C 组与 A、B、E 组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
表1
各时间点 Micro-CT 检测相关指标比较（n=6，
）
Table1.
Comparison of Micro-CT detection related indexes at each time point (n=6, 
)
术后 12 周：① BV/TV，B、D 组与 C、E 组比较以及 B 组与 A 组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。② Tb.N，除 A、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）外，其余组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。③ Tb.Th，组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。④ Tb.Sp，B 组与 A、C、D、E 组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
组内比较，术后 12 周 C 组 BV/TV 及 Tb.Sp、B 组 Tb.N 及 Tb.Th，D 组 Tb.Sp 与 8 周比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余指标组内比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
2.4 生物力学测试
术后 8 周：① 压缩强度：C 组与 A、B、D、E 组比较，B 组与 D、E 组比较，A、E 组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。② 弹性模量：C 组与 A、B、D、E 组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。
术后 12 周：① 压缩强度：C 组与 A、B、D、E 组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。② 弹性模量：C 组与 A、B、E 组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。
组内比较：各组 12 周时压缩强度和弹性模量均大于 8 周，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 2。
表2
各时间点生物力学测试相关指标比较（n=6，
）
Table2.
Comparison of biomechanical test related indexes at each time point (n=6, 
)
3 讨论
3.1 骨缺损模型制备及修复膜应用
在骨缺损区，软组织的修复速度较快，上皮细胞、成纤维细胞长入骨缺损区会对骨细胞产生竞争性抑制而不利于骨形成。而膜引导骨组织再生技术将屏障膜置于骨缺损区和软组织之间，阻断了上皮细胞和成纤维细胞的优先长入，允许具有成骨能力的细胞缓慢进入骨缺损区，达到定向修复骨缺损的目的。本实验采用的屏障膜为吉特瑞医用胶原修复膜，主要成分是从牛腱中提取的Ⅰ型胶原蛋白，宏观结构为白色片状薄膜，微观结构为双面多孔网状片层，致密层保护骨组织再生所需空间，起屏障作用；疏松层有利于生长因子聚集、血管和骨细胞生长，起支架作用。
本研究中，12 周时 F 组骨缺损无法自行愈合，提示选择的直径 6 mm、深 8 mm 骨缺损模型满足临界性骨缺损要求[8]。X 线片检查示，A～E 组骨缺损呈向心性生长，这与于威等[14]关于成骨的发现一致，分析原因是骨缺损中心血液运输及再血管化均不及边缘丰富，新生的胶原纤维网及各类细胞、骨小梁呈向心性减少。殷建等[15]也发现，在兔桡骨骨缺损区局部注射促血管生成素2能使组织工程人工骨早期血管化，促进成骨，进一步表明了血液运输与成骨的关系。
3.2 Micro-CT 及生物力学观测结果分析
本研究在新生骨微观结构方面主要测量了 BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp4 个指标。 BV/TV 与骨形成总量成正相关，Tb.N 和 Tb.Th 与骨吸收量成负相关，Tb.Sp 与骨吸收量成正相关。Micro-CT 测量结果发现，术后 8、12 周时 B 组 BV/TV 及 Tb.N 最大、Tb.Sp 最小，C 组与之相反；提示 B 组新生骨所占比例较大、骨小梁数目较多、骨小梁排列更紧密，而 C 组新生骨所占比例较小、骨小梁数目较少，骨小梁间隙较宽。我们分析原因为 B 组 A-PRF 和 β-TCP 比例优于其他组，两者充分发挥了各自骨诱导、骨引导作用。B 组复合物中 A-PRF 约占 67%，其三维立体网状结构中含丰富血小板和生长因子。血小板浓聚能促进 MSCs 增殖，BMP-2 诱导其分化为软骨和骨，生长因子促进细胞增殖分化和血管再生，尤其是 PDGF 和 VEGF[16-17]。刘鹏鹤等[18]也在临床观察中发现，富含血小板和生长因子的自体血纤维蛋白能促进前交叉韧带重建术后腱-骨愈合。β-TCP 约占 33%，其颗粒直径在 0.5～1.5 mm 之间，气孔率 73%～82%，颗粒间存在不规则间隙[19-20]，它具有与天然松质骨相似的多孔状结构及与正常骨组织相似的 Ca2+和 PO43-含量比值，有良好支架作用[21]，利于细胞攀附、新生血管长入[22-24]。虽然研究表明 A-PRF 从 14～21 d 逐渐开始降解，三维立体结构逐渐消失[25]，但仍然有大多数未降解的 β-TCP 在此过程中继续发挥其骨引导作用，并降解释放出 Ca2+和 PO43-为成骨细胞提供原材料，促进新骨形成[22]。 而 C 组成骨效果差可能是因为复合物中 A-PRF 约 80.0%，β-TCP 含量较少。虽然 A-PRF 富含生长因子，但降解周期较短，释放生长因子时间也较短，且没有足够的 β-TCP 提供空间支架和成骨材料，成骨细胞沉积较少，骨小梁成熟度也差。
在生物力学试验中，对标本的压缩强度和弹性模量进行了测量，可以反映新生骨抵抗断裂和抵抗变形的能力，以此评价新生骨力学性能。术后 8 周及 12 周，B 组压缩强度和弹性模量最高，表明具有良好力学性能，与 Micro-CT 测量结果一致。
综上述，A-PRF 与 β-TCP 复合物能促进骨缺损愈合，以 2∶1 比例复合后修复骨缺损效果更佳。为获得更精确的复合比例，在后续的研究中我们将以 2∶1 为中心细化比例梯度，并且延长实验周期，进一步对 A-PRF 与 β-TCP 相互作用机制，以及不同比例复合物成骨效果差异的原因进行深入研究。
临床常见牙周病、龋病、外伤、肿瘤切除等原因引起的牙列缺损或缺失，由于通常伴不同程度牙槽骨骨量不足，临床种植修复困难。引导骨组织再生术是牙槽骨骨增量技术的重要手段。随着骨组织工程研究的发展，通过结合生长因子与支架材料来诱导骨再生为骨缺损修复提供了新途径。富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是临床骨缺损治疗中常用的自体生长因子供体，所含的生长因子如 TGF-β1、VEGF 等，可持续释放达 7 d[1]。2014 年，Ghanaati 等[2]提出了改良型 PRF（advanced-PRF，A-PRF），其释放生长因子更多、持续时间更长[3-4]。β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）作为骨组织工程常用的支架材料，具有骨引导作用，常与各种具有骨诱导作用的生长因子复合使用。Siddiqui 等[5]将 PRF 与 β-TCP 复合成功用于临床Ⅱ度根分叉病变的治疗。Yilmaz 等[6]发现 β-TCP 与 PRF 复合修复猪胫骨缺损效果优于单纯的 PRF、β-TCP 修复。目前，关于 A-PRF 与 β-TCP 复合物对骨缺损修复作用的研究报道较少。为此，本实验通过构建不同比例的新西兰兔 A-PRF 及 β-TCP 复合物，并修复兔股骨髁骨缺损，探讨 A-PRF 及 β-TCP 复合物修复骨缺损效果并筛选最佳比例，为临床应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6～9 月龄雌性新西兰兔 32 只，体质量 2.5～3.0 kg，由成都达硕实验动物有限公司提供，使用许可证号 SYXK（川）2014-189。实验通过西南医科大学动物实验伦理委员会批准。
β-TCP（OSferion；奥林巴斯泰尔茂生物材料株式会社，日本）；吉特瑞医用胶原修复膜（福建省博特生物科技有限公司）；PRF 工具盒（Process, Nice 公司，法国）；离心机（TDZ4-WS，长沙湘仪集团有限公司）；牙片机（KAVO 公司，德国）；小动物活体断层扫描仪（Micro-CT）、分析软件 Feldkamp（SIEMENS 公司，德国）；生物力学测试系统［协强仪器制造（上海）有限公司］。
1.2 实验分组及方法
1.2.1 分组方法
将 32 只新西兰兔随机分为 6 组，其中 A、B、C、D、E 组为不同比例（1∶1、2∶1、4∶1、1∶2、1∶4，V/V）APRF 与 β-TCP 复合物修复股骨髁骨缺损组，每组各 6 只；F 组（2 只）为空白对照组。
1.2.2 A-PRF 制备
参照本课题组前期实验结果制备 A-PRF[7]。采集各组兔耳中动脉血，于 25℃、以离心半径 12 cm、2 000 r/min 离心 24 min；室温下静置 1 min。离心管上层为无细胞血浆层，中间层为 A-PRF 凝胶，底部为红细胞层。取出 A-PRF 凝胶，置于 PRF 工具盒内剪碎，备用。
1.2.3 动物模型制备及实验方法
取各组动物首先制备股骨髁骨缺损模型。耳缘静脉注射 3% 戊巴比妥溶液（1 mL/kg）麻醉后，自双后肢膝关节外侧距前缘 1.0～1.5 cm 处，平行前缘作一长约 5 cm 弧形切口；逐层分离暴露股骨外侧髁解剖标志，用环形中空取骨钻制备直径 6 mm、深 8 mm 的圆柱形骨缺损[8-12]。于距离骨缺损中央 6 mm 处，左右对称各旋入 1 枚直径 2 mm 的钛钉定位。A～E 组按照 1∶1、2∶1、4∶1、1∶2、1∶4（V/V）比例配置 A-PRF 与 β-TCP 复合物，复合物总量为 0.5 mL，混合均匀。将复合物充填骨缺损，医用胶原修复膜覆盖。见图 1。F 组制备骨缺损后不填充材料，仅用医用胶原修复膜覆盖骨缺损表面。术后 3 d 内每天肌肉注射青霉素钠 80 万 U。术后 8、12 周，A～E 组各取 3 只、F 组各取 1 只动物，耳缘静脉注射过量麻药处死后，取材进行以下观测。
图1
兔股骨髁骨缺损修复模型制备步骤
a. 暴露股骨髁；b. 制备骨缺损；c. 钛钉定位；d. 植入 A-PRF 与 β-TCP 复合物；e. 覆盖医用胶原修复膜
Figure1. The preparation of bone defect and repair model in rabbit femoral condylea. Exposing femur condyle; b. Preparing bone defect; c. Positioning of titanium nail; d. Implanting the A-PRF and β-TCP composite; e. Covering the defect with medical collagen repair membranes
1.3 观测指标
1.3.1 大体观察
各时间点，按照原手术切口入路，逐层分离双后肢股骨髁骨区皮肤和软组织，观察骨缺损表面愈合情况。
1.3.2 X 线片观察
大体观察后，行双后肢股骨髁骨区 X 线片检查，观察骨缺损愈合情况。
1.3.3 Micro-CT 观测
X 线片观察后，双后肢股骨髁骨区行 Micro-CT 扫描，观察新生骨形成情况。扫描条件：扫描高度 1.5 cm，层距 19 μm，跨越 780～800 层，曝光时间 1 800 ms，管电压 80 kV，管电流 500 μA。将获取的 A～E 组 Micro-CT 图像采用 Feldkamp 分析软件进行重建分析，从上至下在距离股骨髁外侧面 2 mm 与 5 mm 处分别取横断面，获得 3 段新生骨区，设定新生骨阈值 500～1 500，β-TCP 颗粒阈值 1 500 以上[13]，测量新生骨相关指标，包括骨体积/组织体积（bone volume/ total volume，BV/TV）、骨小梁数目（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁间隙（trabecular spacing，Tb.Sp）。3 段新生骨区各检测指标取均值。
1.3.4 生物力学测试
Micro-CT 检测后取 A～E 组新生骨组织，修整为高 8 mm、直径 5 mm 的圆柱形。采用生物力学测试系统进行检测，加载速率设定 1 mm/min，沿标本长轴方向加压，期间用生理盐水湿润，直至骨标本破裂骨折后停止加载，计算材料压缩强度和弹性模量。
1.4 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；组内不同时间点间比较采用配对 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 大体观察
术后 8 周，A～E 组骨缺损区均可见新生骨，其中 B 组表面凹陷程度最轻，E 组骨表面凹陷较明显且可见少量 β-TCP 残留；F 组可见纤维肉芽组织充填且骨缺损边界明显。12 周时，A～E 组骨表面仍有轻微凹陷，但较 8 周时凹陷程度轻；骨缺损区新生骨边缘移行不清，尤其 B 组最显著；F 组骨缺损边界内侧见少量骨痂，未见明显新骨生成。各组术后 12 周表面骨质形成均优于 8 周。见图 2。
图2
各组大体观察
从上至下分别为 A、B、C、D、E、F 组a. 术后 8 周；b. 术后 12 周
Figure2. Gross observation of each groupFrom top to bottom for groups A, B, C, D, E, and F, respectively a. At 8 weeks after operation; b. At 12 weeks after operation
2.2 X 线片观察
术后 8 周，F 组低密度骨缺损范围最大且边界清晰，其次为 C、A、D、E 组，B 组骨缺损范围最小。12 周时，F 组缺损范围最大但边界呈雾化状，其次为 C、D、E、A 组范围较小，B 组最小且见较高密度区域移行与周围骨融合；新生骨呈向心性生长；A～E 组低密度骨缺损范围与 8 周时相比，由边缘向中央逐渐减小，且骨密度增高。见图 3。
图3
各组 X 线片观察
从上至下分别为 A、B、C、D、E、F 组a. 术后 8 周；b. 术后 12 周
Figure3. X-ray films of each groupFrom top to bottom for groups A, B, C, D, E, and F, respectively a. At 8 weeks after operation; b. At 12 weeks after operation
2.3 Micro-CT 观测
术后 8 周，A～E 组均可见较清晰排列的骨小梁且骨小梁间髓腔较大；其中 B 组新生骨骨小梁最多，呈条索状或板层状，排列紧密；C 组新生骨小梁最少，呈条状，连续性欠佳，骨小梁间间隙大。12 周时，A～E 组骨小梁均较 8 周时明显增多，排列密集交错，骨小梁间髓腔宽度明显减小，B 组最小，A、C、D、E 组相近。见图 4。
图4
各组 Micro-CT 观察
从上至下分别为 A、B、C、D、E、F 组a. 术后 8 周；b. 术后 12 周
Figure4. Micro-CT observation of each groupFrom top to bottom for groups A, B, C, D, E, and F, respectively a. At 8 weeks after operation; b. At 12 weeks after operation
术后 8 周：① BV/TV，B、D 组与 A、C、E 组比较，B、D 组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。② Tb.N，B、C、E 组与 A、D 组比较以及 B、C、E 组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。③ Tb.Th，组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。④ Tb.Sp，B 组与 D 组比较以及 C 组与 A、B、E 组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
表1
各时间点 Micro-CT 检测相关指标比较（n=6，）
Table1.
Comparison of Micro-CT detection related indexes at each time point (n=6, )
术后 12 周：① BV/TV，B、D 组与 C、E 组比较以及 B 组与 A 组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。② Tb.N，除 A、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）外，其余组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。③ Tb.Th，组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。④ Tb.Sp，B 组与 A、C、D、E 组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
组内比较，术后 12 周 C 组 BV/TV 及 Tb.Sp、B 组 Tb.N 及 Tb.Th，D 组 Tb.Sp 与 8 周比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余指标组内比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
2.4 生物力学测试
术后 8 周：① 压缩强度：C 组与 A、B、D、E 组比较，B 组与 D、E 组比较，A、E 组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。② 弹性模量：C 组与 A、B、D、E 组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。
术后 12 周：① 压缩强度：C 组与 A、B、D、E 组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。② 弹性模量：C 组与 A、B、E 组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。
组内比较：各组 12 周时压缩强度和弹性模量均大于 8 周，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 2。
表2
各时间点生物力学测试相关指标比较（n=6，）
Table2.
Comparison of biomechanical test related indexes at each time point (n=6, )
3 讨论
3.1 骨缺损模型制备及修复膜应用
在骨缺损区，软组织的修复速度较快，上皮细胞、成纤维细胞长入骨缺损区会对骨细胞产生竞争性抑制而不利于骨形成。而膜引导骨组织再生技术将屏障膜置于骨缺损区和软组织之间，阻断了上皮细胞和成纤维细胞的优先长入，允许具有成骨能力的细胞缓慢进入骨缺损区，达到定向修复骨缺损的目的。本实验采用的屏障膜为吉特瑞医用胶原修复膜，主要成分是从牛腱中提取的Ⅰ型胶原蛋白，宏观结构为白色片状薄膜，微观结构为双面多孔网状片层，致密层保护骨组织再生所需空间，起屏障作用；疏松层有利于生长因子聚集、血管和骨细胞生长，起支架作用。
本研究中，12 周时 F 组骨缺损无法自行愈合，提示选择的直径 6 mm、深 8 mm 骨缺损模型满足临界性骨缺损要求[8]。X 线片检查示，A～E 组骨缺损呈向心性生长，这与于威等[14]关于成骨的发现一致，分析原因是骨缺损中心血液运输及再血管化均不及边缘丰富，新生的胶原纤维网及各类细胞、骨小梁呈向心性减少。殷建等[15]也发现，在兔桡骨骨缺损区局部注射促血管生成素2能使组织工程人工骨早期血管化，促进成骨，进一步表明了血液运输与成骨的关系。
3.2 Micro-CT 及生物力学观测结果分析
本研究在新生骨微观结构方面主要测量了 BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp4 个指标。 BV/TV 与骨形成总量成正相关，Tb.N 和 Tb.Th 与骨吸收量成负相关，Tb.Sp 与骨吸收量成正相关。Micro-CT 测量结果发现，术后 8、12 周时 B 组 BV/TV 及 Tb.N 最大、Tb.Sp 最小，C 组与之相反；提示 B 组新生骨所占比例较大、骨小梁数目较多、骨小梁排列更紧密，而 C 组新生骨所占比例较小、骨小梁数目较少，骨小梁间隙较宽。我们分析原因为 B 组 A-PRF 和 β-TCP 比例优于其他组，两者充分发挥了各自骨诱导、骨引导作用。B 组复合物中 A-PRF 约占 67%，其三维立体网状结构中含丰富血小板和生长因子。血小板浓聚能促进 MSCs 增殖，BMP-2 诱导其分化为软骨和骨，生长因子促进细胞增殖分化和血管再生，尤其是 PDGF 和 VEGF[16-17]。刘鹏鹤等[18]也在临床观察中发现，富含血小板和生长因子的自体血纤维蛋白能促进前交叉韧带重建术后腱-骨愈合。β-TCP 约占 33%，其颗粒直径在 0.5～1.5 mm 之间，气孔率 73%～82%，颗粒间存在不规则间隙[19-20]，它具有与天然松质骨相似的多孔状结构及与正常骨组织相似的 Ca2+和 PO43-含量比值，有良好支架作用[21]，利于细胞攀附、新生血管长入[22-24]。虽然研究表明 A-PRF 从 14～21 d 逐渐开始降解，三维立体结构逐渐消失[25]，但仍然有大多数未降解的 β-TCP 在此过程中继续发挥其骨引导作用，并降解释放出 Ca2+和 PO43-为成骨细胞提供原材料，促进新骨形成[22]。 而 C 组成骨效果差可能是因为复合物中 A-PRF 约 80.0%，β-TCP 含量较少。虽然 A-PRF 富含生长因子，但降解周期较短，释放生长因子时间也较短，且没有足够的 β-TCP 提供空间支架和成骨材料，成骨细胞沉积较少，骨小梁成熟度也差。
在生物力学试验中，对标本的压缩强度和弹性模量进行了测量，可以反映新生骨抵抗断裂和抵抗变形的能力，以此评价新生骨力学性能。术后 8 周及 12 周，B 组压缩强度和弹性模量最高，表明具有良好力学性能，与 Micro-CT 测量结果一致。
综上述，A-PRF 与 β-TCP 复合物能促进骨缺损愈合，以 2∶1 比例复合后修复骨缺损效果更佳。为获得更精确的复合比例，在后续的研究中我们将以 2∶1 为中心细化比例梯度，并且延长实验周期，进一步对 A-PRF 与 β-TCP 相互作用机制，以及不同比例复合物成骨效果差异的原因进行深入研究。
