引用本文： 李争争, 赵军伟, 移志刚, 罗伟, 李康, 汪玉良, 汪静, 安丽萍, 马靖林. 脑信号蛋白3A在创伤性颅脑损伤伴胫骨骨折愈合过程中的表达变化. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(10): 1225-1232. doi: 10.7507/1002-1892.20160251 复制
脑信号蛋白3A（Semaphorin 3A，Sema3A）属于信号素家族中Ⅲ型分泌型蛋白，在神经损伤后少突胶质细胞的定向迁移及轴突再生中发挥重要作用。近年来，Sema3A在骨稳态和骨重建方面的研究越来越多，Hayashi等[1]发现Sema3A在成骨细胞中表达，是目前发现的唯一双重调节成骨细胞和破骨细胞的因子；Fukuda等[2]发现神经元分泌的Sema3A通过间接调控骨小梁感觉神经分布来调节骨重塑，而不是直接作用于成骨细胞，独立于局部Sema3A的功能。同时，Hashimoto等[3]发现脊髓横断后，对侧大脑皮质和患侧三叉神经脊束核Sema3A表达上调；Zhang等[4]发现创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI）患者血液中Sema3A浓度上升。TBI后骨折愈合过程中软骨痂生成较多，骨小梁排列疏松、结构紊乱，生物力学强度下降，为病理性骨痂，导致骨折愈合时间延长，甚至骨折不愈合。骨折愈合涉及神经纤维的生成及细胞分化等过程，Sema3A参与调节骨骼神经纤维的长入以及软骨细胞、成骨细胞分化的调节，且Sema3A受神经损伤调控[1, 3-7]。因此，Sema3A在骨折愈合时骨痂中的表达变化可能与TBI及病理性骨痂生成存在密切关系。本实验通过创建TBI合并胫骨骨折模型，探索Sema3A在神经损伤后骨折愈合过程中的表达变化及作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
8～10周龄SPF级健康成年雌性Wistar大鼠192只，体质量220～250g，购于甘肃中医药大学动物实验中心。
兔抗大鼠Sema3A一抗（Santa Cruz公司，美国）；β-actin一抗、超敏二步法免疫组织化学检测试剂盒、辣根过氧化酶标记山羊抗兔二抗、小鼠抗β-actin二抗、山羊血清、载玻片（北京中杉金桥生物工程有限公司）。光学显微镜、体视显微镜（Olympus公司，日本）；AI600超敏多功能成像仪（GE公司，美国）。
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组
将192只大鼠随机分为4组，每组48只，分别为胫骨骨折组（A组）、TBI组（B组）、TBI合并胫骨骨折组（C组）和对照组（D组）。
1.2.2 模型建立
① 右侧胫骨骨折模型：取A、C组大鼠以2%戊巴比妥钠溶液（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉，右侧胫骨备皮。胫骨上段纵向切口，暴露胫骨，于胫骨粗隆钻孔，将1.0 mm克氏针插入胫骨髓腔；于胫骨中上1/3处横断胫骨，克氏针自钻孔顺行插入骨折远端。确认对位对线良好、固定牢靠后，剪断多余克氏针，逐层缝合。
② TBI模型：将Feeney法自由落体颅脑损伤装置适当改进后制备TBI模型[8]。取B、C组大鼠，同上法麻醉，沿大鼠颅脑正中线头皮切口，暴露右侧额骨，体视显微镜下使用牙科磨钻于矢状缝右侧、冠状缝尾侧区域内开窗，直径约6 mm，保持硬脑膜完整。安装打击装置，打击棒下端正对骨窗，打击棒35 g，打击高度40 cm，垂直落下造成脑损伤，明胶海绵局部止血，缝合头皮[9]。术后1 d待麻醉完全苏醒后，按照改良神经功能损伤（NSS）评分[10]，评估TBI模型，均需达到中重度颅脑损伤。
1.3 观测指标
1.3.1 HE染色观察
各组分别于术后3、5、7、14、21、28 d颈椎脱臼处死8只大鼠，A、C组自大鼠骨折断端上下各0.5 cm处剪断，B、D组取相应部位胫骨，4%多聚甲醛固定，15%EDTA-2Na脱钙，常规石蜡切片，行HE染色观察A、C组骨痂形态结构与细胞种类，以及B、D组右侧胫骨相同部位骨膜、皮质、骨小梁及骨髓腔变化。
1.3.2 免疫组织化学染色观察
各组于各时间点取部分切片，按照免疫组织化学染色试剂盒说明书，行Sema3A免疫组织化学染色。于200倍镜下每张切片每个目标区域选取5个不同且不重叠的视野计数阳性细胞，Sema3A阳性染色表现为细胞膜或细胞质呈棕黄色或棕褐色染色，软骨细胞体积大，较易观察；成骨细胞体积较小，不易观察，为骨小梁周围棕黄色或棕褐色条带，条带内成骨细胞核计数即为成骨细胞阳性细胞数。
1.3.3 Western
blot检测Sema3A蛋白表达 各时间点A、C组自大鼠骨折断端上下各0.5 cm处剪断，B、D组取相应部位胫骨，冲洗骨髓腔，低温液氮下研磨骨组织至粉末状；加入1%Triton X-100裂解液[11]冰上裂解2 h，4℃以离心半径6 cm、12 000 r/min离心30 min，吸取上清行BCA蛋白定量；加蛋白上样缓冲液煮沸，用于免疫蛋白印迹。经配胶、电泳、转膜、封闭、孵育抗体后，添加化学发光液，超敏多功能成像仪采集图像，Image J图像分析软件分析图像，以Sema3A/β-actin比值作为Sema3A蛋白相对表达 量。
1.4 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 HE染色观察
D组各时间点骨小梁未见明显异常，无紊乱及断裂，骨膜完整，骨皮质中骨细胞分布、大小均匀（图 1 a）。术后3、5 d，B组与D组相比无明显差异；A、C组骨折线清晰可见，骨折断端无明显骨痂生长，可见炎性细胞及纤维组织填充。7 d，A组骨折断端可见纤维组织自骨膜下向断端间隙生长，骨外膜软骨细胞增生，新生软骨细胞体积较小、排列紧密（图 1 b）；B组骨膜稍紊乱，骨膜下骨皮质轻度增生，骨小梁未见明显异常（图 1 c）；C组骨折断端被纤维组织填充，骨折断端骨外膜下软骨细胞增生，新生软骨细胞体积较大，排列较疏松（图 1 d）。14 d，A组可见骨外膜软骨细胞增生填充骨折断端，生成软骨痂，骨痂中软骨细胞排列规则，软骨痂致密、类骨质较少（图 1 e），软骨痂向骨折断端中心长入，出现新生骨小梁，排列紧密，周围可见较多成骨细胞生成；B组骨膜平整，骨膜下可见轻度增生新生骨小梁及类骨质（图 1 f）；C组骨折断端骨外膜下软骨痂增生，软骨细胞排列疏松，类骨质较多（图 1 g），软骨痂向骨折断端长入，新生骨小梁出现，周围可见少量成骨细胞。21d，A组可见软骨痂逐渐消失被成熟骨小梁代替，新生骨小梁排列紧密、密度高（图 1 h）；B组骨膜平整、连续，骨膜下新生骨小梁及类骨质消失，骨皮质中骨细胞分布正常（图 1 i）；C组软骨痂被新生骨小梁代替，骨小梁排列较疏松、密度低，残存少量软骨细胞及类骨质（图 1 j）。28 d，A、C组骨折线均模糊，A组骨折处愈合良好，骨痂范围缩小，骨小梁排列紧密规则；C组可见大量肥厚性骨痂向外膨胀性生长，骨痂面积明显大于A组，骨小梁结构疏松，排列紊乱；B组无明显异常。
图1
术后各时间点各组HE染色观察（×200） ⓐ D组7 d ⓑ A组7 d ⓒ B组7d ⓓ C组7 d ⓔ A组14 d ⓕ B组14 d ⓖ C组14 d ⓗ A组21 d ⓘ B组21 d ⓙ C组21 d
Figure1.
HE staining observation in 4 groups at different time points after operation (HE×200) ⓐ Group D at 7 days ⓑ Group A at 7 days ⓒ Group B at 7 days
ⓓ Group C at 7 days ⓔ Group A at 14 days ⓕ Group B at 14 days ⓖ Group C at 14 days
ⓗ Group A at 21 days ⓘ Group B at 21 days ⓙGroup C at 21 days
2.2 免疫组织化学染色观察
D组各时间点Sema3A阳性染色无明显差异，主要表达于骨膜、骨小梁周围成骨细胞及骨髓细胞（图 2 a）。术后3、5 d，A、C组Sema3A阳性染色主要表达于骨折断端少量纤维组织及骨髓细胞，B组主要表达于骨膜、骨小梁及骨髓细胞。7 d，A组Sema3A阳性染色在骨折断端骨外膜下增生的软骨细胞无明显表达（图 2 b）；B组主要表达于骨膜、骨小梁周围成骨细胞及骨髓细胞（图 2 c）；C组主要表达于骨折断端骨外膜下增生的软骨细胞（图 2 d）。14d，A组Sema3A阳性染色在骨外膜软骨细胞少量表达（图 2 e），而在骨折断端新生骨小梁周围成骨细胞表达明显增多（图 2 f）；B组主要表达于骨膜、骨膜下新生骨小梁周围的成骨细胞（图 2 g）；C组在骨外膜软骨细胞表达明显增多（图 2 h），而在骨折断端新生骨小梁周围成骨细胞表达较少（图 2 i）。21 d，A组Sema3A阳性染色在骨小梁周围成骨细胞表达较多（图 2 j）；B组主要表达于骨膜、骨小梁周围的成骨细胞及骨髓（图 2 k）；C组在骨小梁周围成骨细胞表达较少，在残存骨痂中软骨细胞继续表达（图 2 l）。28d，A组Sema3A阳性染色表达于骨小梁周围成骨细胞；B组主要表达于骨膜及骨髓；C组表达于骨小梁周围成骨细胞。
图2
术后各时间点各组免疫组织化学染色观察（×200） ⓐ D组7 d ⓑ A组7 d ⓒ B组7 d ⓓ C组7 d ⓔ A组14 d软骨痂中软骨细胞 ⓕ A组14 d新生骨小梁周围成骨细胞 ⓖ B组14 d ⓗ C组14 d软骨痂中软骨细胞 ⓘ C组14 d新生骨小梁周围成骨细胞 ⓙ A组21 d ⓚ B组21 d ⓛ C组21 d
Figure2.
Immunohistochemistry staining in 4 groups different time points after operation ⓐ Group D at 7 days ⓑ Group A at 7days ⓒ Group B at 7 days ⓓ Group C at 7 days ⓔ Group A at 14 days,showing chondrocyte in osteoid callus ⓕ Group A at 14 days,showing osteoblasts in new bone trabecula ⓖ Group B at 14 days ⓗ Group C at 14 days,showing chondrocyte in osteoid callus ⓘ Group C at 14 days showing osteoblasts in new bone trabecula ⓙ Group A at 21 days ⓚ Group B at 21 days ⓛ Group C at 21 days
由于B、D组无骨折，无骨痂生成，B、D组Sema3A阳性染色仅在7、14 d时在骨膜、骨膜下新生骨小梁周围的成骨细胞观察到轻微变化，故只比较了A、C组的统计学结果。而3、5 d骨折断端为血肿、炎性细胞及少许纤维组织，无骨痂或软骨细胞生成，故未纳入统计比较。7 d时A、C组骨折断端骨膜下软骨细胞增生较多，未见成骨细胞生成；28 d时A、C组骨折线均模糊，软骨痂被骨小梁代替，无残存软骨细胞。故最终只统计了A、C组14、21 d的软骨细胞和成骨细胞阳性表达数以及7 d的软骨细胞阳性表达数和28 d的成骨细胞阳性表达数。结果显示，7、14、21 d C组软骨细胞阳性表达数均显著高于A组，14、21d成骨细胞阳性表达数均显著低于A组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；28 d时A、C组间比较软骨细胞及成骨细胞阳性表达数，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。
表1
术后各时间点A、C组Sema3A免疫组织化学染色阳性细胞计数（n=8，x±s）
Table1.
Positive cells of Sema3A of groups A and C at different time points after operation by immunohistochemistry staining（n=8，x±s）
2.3 Western blot检测Sema3A蛋白表达
D组各时间点Sema3A蛋白表达无明显变化；A组Sema3A蛋白表达于术后5 d逐渐升高，14 d达高峰后逐渐下降，28 d恢复正常；B组Sema3A蛋白表达于术后7 d逐渐升高，14 d达高峰，21 d逐渐下降，28 d恢复正常；C组Sema3A蛋白表达于术后5 d逐渐升高，14 d达高峰后缓慢下降，28 d仍在较高水平。见图 3。
图3
Western blot检测术后各时间点各组Sema3A蛋白表达 1：3d 2：5 d 3：7 d 4：14 d 5：21 d 6：28 d
Figure3.
Expression of Sema 3A protein in 4 groups at different time points by Western blot 1: At 3 days 2: At 5 days 3: At 7 days 4: At 14 days 5: At 21 days 6: At 28 days
术后3、5 d各组Sema3A蛋白相对表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。7 d，A、B、C组Sema3A蛋白相对表达量明显高于D组，C组高于A、B组，A组高于B组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。14 d，A、B、C组Sema3A蛋白相对表达量较D组进一步升高，A、C组高于B组，C组高于A组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。21 d，A组Sema3A蛋白相对表达量迅速下降，显著低于B、C组，接近D组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；B、C组显著高于D组，C组高于B组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。28d，C组Sema3A蛋白相对表达量仍显著高于其余3组，B组高于A、D组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；A、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。
表2
Western blot检测术后各时间点各组Sema3A蛋白相对表达量（n=8，x±s）
Table2.
Protein expression of Sema3A at different time points in each group by Western blot（n=8，x±s）
3 讨论
Sema最早于1993年在研究神经生长锥的导向因子时被发现，Sema3A作为Sema家族最典型且最早被确定的神经导向因子，除了在神经损伤后少突胶质细胞的定向迁移及轴突再生中发挥重要作用，在免疫应答、心血管系统的形成以及肿瘤的发生等方面也发挥着重要作用[12, 13, 14, 15, 16]；同时，越来越多研究也发现Sema3A参与骨重建与骨重塑[1, 2]。
Okubo等[7]发现在人骨性关节炎中，Sema3A在软骨细胞表达较正常软骨显著升高，并且其表达与软骨细胞克隆密切相关，通过抑制VEGF165介导的软骨细胞迁移而促进软骨细胞克隆。软骨细胞克隆是软骨细胞在受损部位增殖以完成局部修复，但细胞不能自由移动到其他地方，最终发育成软骨细胞群。本研究中，骨折愈合原始骨痂形成期，Sema3A在C组骨外膜软骨痂软骨细胞中表达显著高于A组，可能同样引起软骨细胞在局部的过度增殖，具体机制尚不清楚。Gomez等[6]研究发现，体外培养成骨细胞和软骨细胞分化时表达Sema3A信号系统的许多分子，Sema3A亦可能参与了软骨细胞的分化。因此Sema3A在软骨细胞过表达，促进软骨细胞过度增生、分化，可能是TBI后骨折愈合中软骨痂异常增多的原因之一。
Gomez等[6]发现在体内神经、血管侵入软骨内骨化中心前，Sema3A表达于骨化中心的前肥大和肥大软骨细胞，Sema3A在时间和空间模式上的表达平行于骨组织的神经支配、甚至更早，表明软骨细胞表达Sema3A信号系统，是骨化中心的神经和血管能够有序长入所必需的。健康椎间盘内无血管和神经纤维，椎间盘变性过程中有伤害性神经纤维和血管由变性椎间盘外向内生长，这可能与疼痛有关[17]。Tolofari等[18]在研究椎间盘变性中发现Sema3A在健康椎间盘内充当神经长入的屏障，主要高度表达在外纤维环，而变性椎间盘在这一区域显著下降。Tanelian等[19]在成年兔角膜上皮细胞转染Sema3A，可排斥三叉神经感觉神经的传入。以上研究均提示，Sema3A在局部的高表达可能影响神经纤维在组织局部的长入。Behar等[20]研究发现，Sema3A基因敲除小鼠出现软骨结构异常、椎体融合、部分肋骨重合等骨发育异常。Fukuda等[2]发现神经元分泌的Sema3A与观察到的骨量异常有关，独立于骨局部的Sema3A作用，进一步研究表明神经元通过自分泌Sema3A调节感觉神经纤维在骨小梁的分布。提示感觉神经元分泌的Sema3A调节骨发育通过调节感觉神经纤维在骨小梁的分布间接调节骨重塑，而不是直接作用于成骨细胞。因此，TBI后骨折愈合过程中，软骨细胞过表达Sema3A，局部异常表达的Sema3A可能排斥感觉神经纤维在骨痂部位的长入，感觉神经支配减少后，由感觉神经纤维自分泌的Sema3A介导的新生感觉神经纤维进一步减少，引起参与骨调节的相关神经肽的分泌异常，可能是TBI后骨折愈合过程中软骨痂异常增多的原因之一。屈墨羱等[21]在骨质疏松大鼠骨折模型的骨折局部给予注射Sema3A，发现能促进骨折愈合中期骨痂形成，缩短骨痂形成周期，进一步印证了Sema3A可介导软骨痂异常增多。
Hayashi等[1]研究发现Sema3A 在成骨细胞中表达，双重调节破骨细胞和成骨细胞，进一步研究发现Sema3A主要通过与其受体Nrp-1结合，阻断下游的ITAM和Rho A信号通路，抑制RANKL诱导的破骨细胞分化，通过经典的Wnt 3a-β-catenin-Runx2蛋白信号通路促进成骨细胞分化。邱雨等[22]在Sema3A对成牙骨质细胞系增殖和矿化功能研究中发现，Sema3A通过抑制骨钙素和Runx2基因表达，从而抑制细胞的矿化能力，成牙骨质细胞与成骨细胞有相似之处，两者均与矿化有关。本研究中，C组Sema3A在软骨痂新生骨小梁周围的成骨细胞表达明显低于A组，Sema3A成骨细胞分化降低，这可能是TBI后骨折愈合时骨小梁排列疏松、骨痂生物力学强度差、软骨痂向硬骨痂转换障碍的原因之一。
综上述，Sema3A在TBI后骨折愈合过程中，在软骨痂中软骨细胞高表达、新生骨小梁周围成骨细胞低表达，可能通过影响软骨细胞分化、增生，排斥软骨痂骨化中心内感觉神经纤维长入，未能及时调控成骨细胞分化促进新生骨小梁成熟，是导致TBI后骨折愈合时软骨痂生成较多、新生骨小梁排列疏松、骨痂生物强度降低的原因之一。通过对TBI后骨折愈合过程中Sema3A在空间和时间表达模式上的研究发现，Sema3A可能在TBI后的骨折愈合中发挥了重要作用。Nrp-1是Sema3A的功能性受体[23]，目前对于Sema3A及Nrp-1的相关研究中报道的阻滞剂，如SICHI[24]、decorin[25]、Nrp-1抑制肽[26]等均不理想，进行相关干预后未进一步观察软骨细胞、成骨细胞、感觉神经纤维分布等的变化，为本研究不足之处，但为后续相关干预提供了初步的理论基础。随着对Sema3A及其阻滞剂的进一步研究，将为TBI后骨折愈合的治疗提供更多理论依据。
脑信号蛋白3A（Semaphorin 3A，Sema3A）属于信号素家族中Ⅲ型分泌型蛋白，在神经损伤后少突胶质细胞的定向迁移及轴突再生中发挥重要作用。近年来，Sema3A在骨稳态和骨重建方面的研究越来越多，Hayashi等[1]发现Sema3A在成骨细胞中表达，是目前发现的唯一双重调节成骨细胞和破骨细胞的因子；Fukuda等[2]发现神经元分泌的Sema3A通过间接调控骨小梁感觉神经分布来调节骨重塑，而不是直接作用于成骨细胞，独立于局部Sema3A的功能。同时，Hashimoto等[3]发现脊髓横断后，对侧大脑皮质和患侧三叉神经脊束核Sema3A表达上调；Zhang等[4]发现创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI）患者血液中Sema3A浓度上升。TBI后骨折愈合过程中软骨痂生成较多，骨小梁排列疏松、结构紊乱，生物力学强度下降，为病理性骨痂，导致骨折愈合时间延长，甚至骨折不愈合。骨折愈合涉及神经纤维的生成及细胞分化等过程，Sema3A参与调节骨骼神经纤维的长入以及软骨细胞、成骨细胞分化的调节，且Sema3A受神经损伤调控[1, 3-7]。因此，Sema3A在骨折愈合时骨痂中的表达变化可能与TBI及病理性骨痂生成存在密切关系。本实验通过创建TBI合并胫骨骨折模型，探索Sema3A在神经损伤后骨折愈合过程中的表达变化及作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
8～10周龄SPF级健康成年雌性Wistar大鼠192只，体质量220～250g，购于甘肃中医药大学动物实验中心。
兔抗大鼠Sema3A一抗（Santa Cruz公司，美国）；β-actin一抗、超敏二步法免疫组织化学检测试剂盒、辣根过氧化酶标记山羊抗兔二抗、小鼠抗β-actin二抗、山羊血清、载玻片（北京中杉金桥生物工程有限公司）。光学显微镜、体视显微镜（Olympus公司，日本）；AI600超敏多功能成像仪（GE公司，美国）。
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组
将192只大鼠随机分为4组，每组48只，分别为胫骨骨折组（A组）、TBI组（B组）、TBI合并胫骨骨折组（C组）和对照组（D组）。
1.2.2 模型建立
① 右侧胫骨骨折模型：取A、C组大鼠以2%戊巴比妥钠溶液（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉，右侧胫骨备皮。胫骨上段纵向切口，暴露胫骨，于胫骨粗隆钻孔，将1.0 mm克氏针插入胫骨髓腔；于胫骨中上1/3处横断胫骨，克氏针自钻孔顺行插入骨折远端。确认对位对线良好、固定牢靠后，剪断多余克氏针，逐层缝合。
② TBI模型：将Feeney法自由落体颅脑损伤装置适当改进后制备TBI模型[8]。取B、C组大鼠，同上法麻醉，沿大鼠颅脑正中线头皮切口，暴露右侧额骨，体视显微镜下使用牙科磨钻于矢状缝右侧、冠状缝尾侧区域内开窗，直径约6 mm，保持硬脑膜完整。安装打击装置，打击棒下端正对骨窗，打击棒35 g，打击高度40 cm，垂直落下造成脑损伤，明胶海绵局部止血，缝合头皮[9]。术后1 d待麻醉完全苏醒后，按照改良神经功能损伤（NSS）评分[10]，评估TBI模型，均需达到中重度颅脑损伤。
1.3 观测指标
1.3.1 HE染色观察
各组分别于术后3、5、7、14、21、28 d颈椎脱臼处死8只大鼠，A、C组自大鼠骨折断端上下各0.5 cm处剪断，B、D组取相应部位胫骨，4%多聚甲醛固定，15%EDTA-2Na脱钙，常规石蜡切片，行HE染色观察A、C组骨痂形态结构与细胞种类，以及B、D组右侧胫骨相同部位骨膜、皮质、骨小梁及骨髓腔变化。
1.3.2 免疫组织化学染色观察
各组于各时间点取部分切片，按照免疫组织化学染色试剂盒说明书，行Sema3A免疫组织化学染色。于200倍镜下每张切片每个目标区域选取5个不同且不重叠的视野计数阳性细胞，Sema3A阳性染色表现为细胞膜或细胞质呈棕黄色或棕褐色染色，软骨细胞体积大，较易观察；成骨细胞体积较小，不易观察，为骨小梁周围棕黄色或棕褐色条带，条带内成骨细胞核计数即为成骨细胞阳性细胞数。
1.3.3 Western
blot检测Sema3A蛋白表达 各时间点A、C组自大鼠骨折断端上下各0.5 cm处剪断，B、D组取相应部位胫骨，冲洗骨髓腔，低温液氮下研磨骨组织至粉末状；加入1%Triton X-100裂解液[11]冰上裂解2 h，4℃以离心半径6 cm、12 000 r/min离心30 min，吸取上清行BCA蛋白定量；加蛋白上样缓冲液煮沸，用于免疫蛋白印迹。经配胶、电泳、转膜、封闭、孵育抗体后，添加化学发光液，超敏多功能成像仪采集图像，Image J图像分析软件分析图像，以Sema3A/β-actin比值作为Sema3A蛋白相对表达 量。
1.4 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 HE染色观察
D组各时间点骨小梁未见明显异常，无紊乱及断裂，骨膜完整，骨皮质中骨细胞分布、大小均匀（图 1 a）。术后3、5 d，B组与D组相比无明显差异；A、C组骨折线清晰可见，骨折断端无明显骨痂生长，可见炎性细胞及纤维组织填充。7 d，A组骨折断端可见纤维组织自骨膜下向断端间隙生长，骨外膜软骨细胞增生，新生软骨细胞体积较小、排列紧密（图 1 b）；B组骨膜稍紊乱，骨膜下骨皮质轻度增生，骨小梁未见明显异常（图 1 c）；C组骨折断端被纤维组织填充，骨折断端骨外膜下软骨细胞增生，新生软骨细胞体积较大，排列较疏松（图 1 d）。14 d，A组可见骨外膜软骨细胞增生填充骨折断端，生成软骨痂，骨痂中软骨细胞排列规则，软骨痂致密、类骨质较少（图 1 e），软骨痂向骨折断端中心长入，出现新生骨小梁，排列紧密，周围可见较多成骨细胞生成；B组骨膜平整，骨膜下可见轻度增生新生骨小梁及类骨质（图 1 f）；C组骨折断端骨外膜下软骨痂增生，软骨细胞排列疏松，类骨质较多（图 1 g），软骨痂向骨折断端长入，新生骨小梁出现，周围可见少量成骨细胞。21d，A组可见软骨痂逐渐消失被成熟骨小梁代替，新生骨小梁排列紧密、密度高（图 1 h）；B组骨膜平整、连续，骨膜下新生骨小梁及类骨质消失，骨皮质中骨细胞分布正常（图 1 i）；C组软骨痂被新生骨小梁代替，骨小梁排列较疏松、密度低，残存少量软骨细胞及类骨质（图 1 j）。28 d，A、C组骨折线均模糊，A组骨折处愈合良好，骨痂范围缩小，骨小梁排列紧密规则；C组可见大量肥厚性骨痂向外膨胀性生长，骨痂面积明显大于A组，骨小梁结构疏松，排列紊乱；B组无明显异常。
图1
术后各时间点各组HE染色观察（×200） ⓐ D组7 d ⓑ A组7 d ⓒ B组7d ⓓ C组7 d ⓔ A组14 d ⓕ B组14 d ⓖ C组14 d ⓗ A组21 d ⓘ B组21 d ⓙ C组21 d
Figure1.
HE staining observation in 4 groups at different time points after operation (HE×200) ⓐ Group D at 7 days ⓑ Group A at 7 days ⓒ Group B at 7 days
ⓓ Group C at 7 days ⓔ Group A at 14 days ⓕ Group B at 14 days ⓖ Group C at 14 days
ⓗ Group A at 21 days ⓘ Group B at 21 days ⓙGroup C at 21 days
2.2 免疫组织化学染色观察
D组各时间点Sema3A阳性染色无明显差异，主要表达于骨膜、骨小梁周围成骨细胞及骨髓细胞（图 2 a）。术后3、5 d，A、C组Sema3A阳性染色主要表达于骨折断端少量纤维组织及骨髓细胞，B组主要表达于骨膜、骨小梁及骨髓细胞。7 d，A组Sema3A阳性染色在骨折断端骨外膜下增生的软骨细胞无明显表达（图 2 b）；B组主要表达于骨膜、骨小梁周围成骨细胞及骨髓细胞（图 2 c）；C组主要表达于骨折断端骨外膜下增生的软骨细胞（图 2 d）。14d，A组Sema3A阳性染色在骨外膜软骨细胞少量表达（图 2 e），而在骨折断端新生骨小梁周围成骨细胞表达明显增多（图 2 f）；B组主要表达于骨膜、骨膜下新生骨小梁周围的成骨细胞（图 2 g）；C组在骨外膜软骨细胞表达明显增多（图 2 h），而在骨折断端新生骨小梁周围成骨细胞表达较少（图 2 i）。21 d，A组Sema3A阳性染色在骨小梁周围成骨细胞表达较多（图 2 j）；B组主要表达于骨膜、骨小梁周围的成骨细胞及骨髓（图 2 k）；C组在骨小梁周围成骨细胞表达较少，在残存骨痂中软骨细胞继续表达（图 2 l）。28d，A组Sema3A阳性染色表达于骨小梁周围成骨细胞；B组主要表达于骨膜及骨髓；C组表达于骨小梁周围成骨细胞。
图2
术后各时间点各组免疫组织化学染色观察（×200） ⓐ D组7 d ⓑ A组7 d ⓒ B组7 d ⓓ C组7 d ⓔ A组14 d软骨痂中软骨细胞 ⓕ A组14 d新生骨小梁周围成骨细胞 ⓖ B组14 d ⓗ C组14 d软骨痂中软骨细胞 ⓘ C组14 d新生骨小梁周围成骨细胞 ⓙ A组21 d ⓚ B组21 d ⓛ C组21 d
Figure2.
Immunohistochemistry staining in 4 groups different time points after operation ⓐ Group D at 7 days ⓑ Group A at 7days ⓒ Group B at 7 days ⓓ Group C at 7 days ⓔ Group A at 14 days,showing chondrocyte in osteoid callus ⓕ Group A at 14 days,showing osteoblasts in new bone trabecula ⓖ Group B at 14 days ⓗ Group C at 14 days,showing chondrocyte in osteoid callus ⓘ Group C at 14 days showing osteoblasts in new bone trabecula ⓙ Group A at 21 days ⓚ Group B at 21 days ⓛ Group C at 21 days
由于B、D组无骨折，无骨痂生成，B、D组Sema3A阳性染色仅在7、14 d时在骨膜、骨膜下新生骨小梁周围的成骨细胞观察到轻微变化，故只比较了A、C组的统计学结果。而3、5 d骨折断端为血肿、炎性细胞及少许纤维组织，无骨痂或软骨细胞生成，故未纳入统计比较。7 d时A、C组骨折断端骨膜下软骨细胞增生较多，未见成骨细胞生成；28 d时A、C组骨折线均模糊，软骨痂被骨小梁代替，无残存软骨细胞。故最终只统计了A、C组14、21 d的软骨细胞和成骨细胞阳性表达数以及7 d的软骨细胞阳性表达数和28 d的成骨细胞阳性表达数。结果显示，7、14、21 d C组软骨细胞阳性表达数均显著高于A组，14、21d成骨细胞阳性表达数均显著低于A组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；28 d时A、C组间比较软骨细胞及成骨细胞阳性表达数，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。
表1
术后各时间点A、C组Sema3A免疫组织化学染色阳性细胞计数（n=8，x±s）
Table1.
Positive cells of Sema3A of groups A and C at different time points after operation by immunohistochemistry staining（n=8，x±s）
2.3 Western blot检测Sema3A蛋白表达
D组各时间点Sema3A蛋白表达无明显变化；A组Sema3A蛋白表达于术后5 d逐渐升高，14 d达高峰后逐渐下降，28 d恢复正常；B组Sema3A蛋白表达于术后7 d逐渐升高，14 d达高峰，21 d逐渐下降，28 d恢复正常；C组Sema3A蛋白表达于术后5 d逐渐升高，14 d达高峰后缓慢下降，28 d仍在较高水平。见图 3。
图3
Western blot检测术后各时间点各组Sema3A蛋白表达 1：3d 2：5 d 3：7 d 4：14 d 5：21 d 6：28 d
Figure3.
Expression of Sema 3A protein in 4 groups at different time points by Western blot 1: At 3 days 2: At 5 days 3: At 7 days 4: At 14 days 5: At 21 days 6: At 28 days
术后3、5 d各组Sema3A蛋白相对表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。7 d，A、B、C组Sema3A蛋白相对表达量明显高于D组，C组高于A、B组，A组高于B组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。14 d，A、B、C组Sema3A蛋白相对表达量较D组进一步升高，A、C组高于B组，C组高于A组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。21 d，A组Sema3A蛋白相对表达量迅速下降，显著低于B、C组，接近D组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；B、C组显著高于D组，C组高于B组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。28d，C组Sema3A蛋白相对表达量仍显著高于其余3组，B组高于A、D组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；A、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。
表2
Western blot检测术后各时间点各组Sema3A蛋白相对表达量（n=8，x±s）
Table2.
Protein expression of Sema3A at different time points in each group by Western blot（n=8，x±s）
3 讨论
Sema最早于1993年在研究神经生长锥的导向因子时被发现，Sema3A作为Sema家族最典型且最早被确定的神经导向因子，除了在神经损伤后少突胶质细胞的定向迁移及轴突再生中发挥重要作用，在免疫应答、心血管系统的形成以及肿瘤的发生等方面也发挥着重要作用[12, 13, 14, 15, 16]；同时，越来越多研究也发现Sema3A参与骨重建与骨重塑[1, 2]。
Okubo等[7]发现在人骨性关节炎中，Sema3A在软骨细胞表达较正常软骨显著升高，并且其表达与软骨细胞克隆密切相关，通过抑制VEGF165介导的软骨细胞迁移而促进软骨细胞克隆。软骨细胞克隆是软骨细胞在受损部位增殖以完成局部修复，但细胞不能自由移动到其他地方，最终发育成软骨细胞群。本研究中，骨折愈合原始骨痂形成期，Sema3A在C组骨外膜软骨痂软骨细胞中表达显著高于A组，可能同样引起软骨细胞在局部的过度增殖，具体机制尚不清楚。Gomez等[6]研究发现，体外培养成骨细胞和软骨细胞分化时表达Sema3A信号系统的许多分子，Sema3A亦可能参与了软骨细胞的分化。因此Sema3A在软骨细胞过表达，促进软骨细胞过度增生、分化，可能是TBI后骨折愈合中软骨痂异常增多的原因之一。
Gomez等[6]发现在体内神经、血管侵入软骨内骨化中心前，Sema3A表达于骨化中心的前肥大和肥大软骨细胞，Sema3A在时间和空间模式上的表达平行于骨组织的神经支配、甚至更早，表明软骨细胞表达Sema3A信号系统，是骨化中心的神经和血管能够有序长入所必需的。健康椎间盘内无血管和神经纤维，椎间盘变性过程中有伤害性神经纤维和血管由变性椎间盘外向内生长，这可能与疼痛有关[17]。Tolofari等[18]在研究椎间盘变性中发现Sema3A在健康椎间盘内充当神经长入的屏障，主要高度表达在外纤维环，而变性椎间盘在这一区域显著下降。Tanelian等[19]在成年兔角膜上皮细胞转染Sema3A，可排斥三叉神经感觉神经的传入。以上研究均提示，Sema3A在局部的高表达可能影响神经纤维在组织局部的长入。Behar等[20]研究发现，Sema3A基因敲除小鼠出现软骨结构异常、椎体融合、部分肋骨重合等骨发育异常。Fukuda等[2]发现神经元分泌的Sema3A与观察到的骨量异常有关，独立于骨局部的Sema3A作用，进一步研究表明神经元通过自分泌Sema3A调节感觉神经纤维在骨小梁的分布。提示感觉神经元分泌的Sema3A调节骨发育通过调节感觉神经纤维在骨小梁的分布间接调节骨重塑，而不是直接作用于成骨细胞。因此，TBI后骨折愈合过程中，软骨细胞过表达Sema3A，局部异常表达的Sema3A可能排斥感觉神经纤维在骨痂部位的长入，感觉神经支配减少后，由感觉神经纤维自分泌的Sema3A介导的新生感觉神经纤维进一步减少，引起参与骨调节的相关神经肽的分泌异常，可能是TBI后骨折愈合过程中软骨痂异常增多的原因之一。屈墨羱等[21]在骨质疏松大鼠骨折模型的骨折局部给予注射Sema3A，发现能促进骨折愈合中期骨痂形成，缩短骨痂形成周期，进一步印证了Sema3A可介导软骨痂异常增多。
Hayashi等[1]研究发现Sema3A 在成骨细胞中表达，双重调节破骨细胞和成骨细胞，进一步研究发现Sema3A主要通过与其受体Nrp-1结合，阻断下游的ITAM和Rho A信号通路，抑制RANKL诱导的破骨细胞分化，通过经典的Wnt 3a-β-catenin-Runx2蛋白信号通路促进成骨细胞分化。邱雨等[22]在Sema3A对成牙骨质细胞系增殖和矿化功能研究中发现，Sema3A通过抑制骨钙素和Runx2基因表达，从而抑制细胞的矿化能力，成牙骨质细胞与成骨细胞有相似之处，两者均与矿化有关。本研究中，C组Sema3A在软骨痂新生骨小梁周围的成骨细胞表达明显低于A组，Sema3A成骨细胞分化降低，这可能是TBI后骨折愈合时骨小梁排列疏松、骨痂生物力学强度差、软骨痂向硬骨痂转换障碍的原因之一。
综上述，Sema3A在TBI后骨折愈合过程中，在软骨痂中软骨细胞高表达、新生骨小梁周围成骨细胞低表达，可能通过影响软骨细胞分化、增生，排斥软骨痂骨化中心内感觉神经纤维长入，未能及时调控成骨细胞分化促进新生骨小梁成熟，是导致TBI后骨折愈合时软骨痂生成较多、新生骨小梁排列疏松、骨痂生物强度降低的原因之一。通过对TBI后骨折愈合过程中Sema3A在空间和时间表达模式上的研究发现，Sema3A可能在TBI后的骨折愈合中发挥了重要作用。Nrp-1是Sema3A的功能性受体[23]，目前对于Sema3A及Nrp-1的相关研究中报道的阻滞剂，如SICHI[24]、decorin[25]、Nrp-1抑制肽[26]等均不理想，进行相关干预后未进一步观察软骨细胞、成骨细胞、感觉神经纤维分布等的变化，为本研究不足之处，但为后续相关干预提供了初步的理论基础。随着对Sema3A及其阻滞剂的进一步研究，将为TBI后骨折愈合的治疗提供更多理论依据。
