引用本文： 曹杰, 王旻, 解慧琪, 魏人前. 小肠黏膜下层-蚕丝复合前交叉韧带重建支架的初步研究. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(12): 1534-1540. doi: 10.7507/1002-1892.20150328 复制
前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）是维持膝关节稳定性的重要韧带，撕裂后自我修复能力较差，多数需要通过手术重建，以恢复膝关节稳定性。目前，临床常用的韧带移植物包括自体肌腱、同种异体移植物和人工韧带，但应用时存在损害人体正常组织、免疫排斥反应、潜在的疾病传播风险以及疲劳断裂等缺点[1-3]；此外，还存在重建后关节液渗入骨隧道影响腱-骨愈合[4-5]等问题。因此，寻找一种更理想的ACL重建移植物成为研究热点。蚕丝是一种天然生物材料，因其弹性和强度的理想结合以及具有良好的生物相容性，成为理想的韧带组织工程支架材料[6]。2002年，Altman等[6]研究表明蚕丝纤维能促进人BMSCs的增殖和分化，并上调韧带相关基因的表达。之后有研究通过在蚕丝支架内添加微孔蚕丝海绵[7-8]和复合Ⅰ型胶原[9]等方法改进蚕丝支架，于动物体内重建ACL后均达到了较好效 果。
小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）是一种天然的细胞外基质衍生材料，富含Ⅰ、Ⅲ型胶原[10]，并含有VEGF、FGF、TGF、EDGF等多种细胞活性因子[11]。SIS的生物相容性好、免疫原性低[12]，体内移植后能迅速诱导细胞浸润，刺激血管生成，使修复部位早期血管化，诱导特定部位的组织重塑[13-15]，在组织工程肌腱、软骨、骨膜、皮肤等领域[16-20]获得广泛应用。
韧带支架的早期血管化能为支架尽早提供血运，加速支架体内韧带化过程[21-22]。据此，本实验拟在蚕丝支架上添加能促进早期血管化的SIS，构建SIS-蚕丝复合支架，探究其生物力学性能和是否具有早期血管化能力，以及能否解决ACL重建后关节液渗入骨隧道造成腱-骨愈合不良的问题。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
28周龄雄性新西兰大白兔20只，体质量2.5～ 3.0 kg；6周龄雄性SD大鼠30只，体质量180～200 g；均由四川大学动物实验中心提供。
蚕丝（四川大学纺织学院）；新鲜猪小肠（成都肉联厂）；L-DMEM培养基、FBS、胰蛋白酶、人用淋巴细胞分离液（GIBCO公司，美国）；钙黄绿素（calcein-acetoxymethylester，Calcein-AM）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）（Sigma公司，美国）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8；株式会社同仁化学研究所，日本）。
液压式伺服动静态生物力学测试系统（Instron公司，美国）；Model X-630 型扫描电镜（Hitachi公司，日本）；CO2细胞培养箱（SANYO公司，日本）；超净工作台（Thermo公司，美国）；E600型荧光显微镜、TE2000-U型光学显微镜（Nikon公司，日本）；连续光谱微孔板测读仪（Molecular Devices公司，美国）；DT9205A数字万用表（HT公司，日本）。
1.2 支架材料制备及相关观测
1.2.1 SIS制备
参考文献[10]方法将新鲜猪小肠冲洗干净，剪成15 cm左右的小段，沿长轴剖开，用纱布包绕手术刀柄，刮除小肠黏膜层、肌层、浆膜层，将获得的黏膜下层依次经过脱脂、脱细胞、去病毒处理后冷冻，最后冻干备用。
1.2.2 蚕丝支架制备
将蚕丝缠绕固定于玻璃支架上，置于0.02 mol/L碳酸钠溶液中，100℃水浴1.5 h，完全脱去表面丝胶蛋白[23]；最后双蒸水冲洗10次，通风柜风干备用。脱胶后蚕丝以双蒸水润湿后缠绕于相距7 cm的固定针头两端，共缠绕40圈，将一端针头固定，另一端针头反方向旋转10圈，从中间折叠扭曲制成直径2 mm、长30 mm、具有螺旋结构的编织蚕丝束。蚕丝束两端分别用2根2-0涤纶线以锁边缝合法缝合编织成长10 cm的双股牵引线，风干，环氧乙烷灭菌备用。
1.2.3 复合支架制备
将SIS修剪成4 cm×2 cm的方形膜片，双蒸水润湿，包绕在蚕丝支架外围。用5-0滑线缝合固定SIS边缘，以维持外围SIS形成的圆筒状结构。再用2根2-0涤纶线锁边缝合复合支架两端，作为支架牵引线。
1.2.4 支架观察
① 大体观察：取双蒸水润湿后的蚕丝支架和复合支架，观察支架表面形态。② 生物力学性能测定：取蚕丝支架与复合支架用去离子水浸泡过夜，液压式伺服动静态生物力学测试系统夹具夹紧支架两端进行单轴拉力测试。加载速度10 mm/min，每组10个标本，连续记录并绘制载荷-位移曲线。依据载荷-位移曲线，计算最大载荷、形变量和刚度。
1.3 支架材料细胞相容性评价
1.3.1 兔BMSCs分离培养
参考文献[24-25]方法，通过密度梯度离心获取新西兰大白兔原代BMSCs，用含10%FBS的L-DMEM培养基培养，细胞生长融合至90%时，以胰蛋白酶消化传代，取第3代细胞冻存备用。
1.3.2 活死细胞染色观察
蚕丝脱胶后按文献[7]方法制成蚕丝海绵，以束状铺于6孔板孔底，作为蚕丝支架组；将SIS修剪制成直径为16 mm 的圆片置于6孔板孔底，其上再铺蚕丝海绵，作为复合支架组。每组设3个复孔，环氧乙烷灭菌。取培养的第3代兔BMSCs，以 1×105个/孔密度分别接种于两组材料上，在含10%FBS的L-DMEM 培养基中培养；分别于接种后1、5 d吸出培养基，PBS洗2遍，加入2 mL Calcein-AM/PI溶液，室温下避光染色30 min；PBS洗2遍，荧光显微镜下观察细胞形态及生长黏附情况，细胞绿染为活细胞，红染为死细胞。
1.3.3 CCK-8法检测细胞增殖活力
支架材料浸提液制备：根据GB/T16886.12标准规定的浸提比例（0.2 g/mL）[19]，将蚕丝支架、复合支架灭菌后浸泡于L-DMEM培养基中，37℃、5%CO2及饱和湿度细胞培养箱中浸提24 h，按照10%比例添加FBS制得蚕丝支架与复合支架浸提液。
取第3代兔BMSCs以2×103个/孔密度接种于96孔板中，于37℃、5%CO2及饱和湿度细胞培养箱中培养4 h，使细胞充分贴壁，弃原液。将细胞分别采用蚕丝支架浸提液（A组）、复合支架浸提液（B组）及正常细胞培养液（C组）培养，于0、1、3、5、7、9 d后每孔加110 μL CCK-8溶液，37℃、5%CO2及饱和湿度细胞培养箱中孵育3 h，采用酶标仪于450 nm波长下测量吸光度（A）值，并绘制细胞生长曲线。
1.4 支架材料组织相容性评价
将30只SD大鼠随机分为蚕丝支架组（S组）和复合支架组（SS组），每组15只。大鼠以腹腔注射10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）麻醉后背部去毛，无菌条件下于背部正中作纵切口，深至皮下筋膜层，向两边钝性分离皮下组织；切口两侧各植入2个1 cm长支架材料，缝合皮肤，正常分笼饲养。术后2、4、8 周每组各处死5只大鼠，取材行 HE染色观察材料组织相容性。每张切片于高倍镜（×400）下选取5个视野，计数各时间点炎性细胞（细胞核大、蓝染）和新生血管，并观察材料中SIS的降解情况。
1.5 支架材料减缓胫骨隧道关节液渗入能力评价
1.5.1 兔膝关节重建模型制备
取20只新西兰大白兔，每只均行双侧后肢ACL重建，左后肢为蚕丝支架重建组（S组），右后肢为复合支架重建组（SS组）。兔以耳缘静脉注射3%戊巴比妥（1.5 mL/kg）麻醉，双膝关节备皮。无菌条件下行髌骨内缘膝关节切开术，切开关节腔，切除部分髌下脂肪垫，暴露ACL，在股骨、胫骨韧带止点处完全切除ACL，用2.0 mm钻头在韧带止点处分别钻取股骨及胫骨隧道，沿牵引线将对应移植物拉入骨隧道，移植物末端用松质骨螺钉固定，屈曲30°拉紧移植物，拧紧两端螺钉。关节腔冲洗后逐层缝合，关闭切口。在ACL重建模型完成后即刻，于胫骨平台下1 cm处，在胫骨隧道前内侧作大小为1.0 cm×0.5 cm的骨窗，显露移植物，分别取10只动物用于电解液灌注后移植物电阻值测定和墨水灌注渗出时间测定。
1.5.2 电解液灌注后移植物电阻值测定
参照文献[26]方法，用生理盐水浸泡新鲜制备的蚕丝支架与复合支架1 min 后，用电阻仪分别测量两组支架上1 cm距离的电阻值，定为初始电阻。再将测量后的蚕丝支架与复合支架浸泡于10%NaCl溶液中1 min，再次测量电阻值，定为饱和电阻。将兔膝关节ACL重建模型固定于铁架台上，保持胫骨关节面与地面平行。将电阻仪正极置于骨窗最上端移植物表面，负极置于相距1 cm的下端移植物表面。向关节腔内缓慢注入10%NaCl溶液5 mL，于停止注射后0、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90 min测量电阻值。每个时间点完成测量后均屈伸膝关节3 次，每个时间点测量3次，取均值，并绘制电阻-时间曲线 图。
1.5.3 墨水灌注渗出时间观察
在500 mL生理盐水中注入5 mL碳素墨水，高温高压消毒，制成黑色生理盐水染液。兔膝关节ACL重建模型建立后，向兔关节腔内缓慢注入5 mL黑色生理盐水染液，每隔5 min屈伸膝关节3次。用相机录像模式记录渗出过程，观察墨水从骨窗开始渗出时间及流注时间（渗出结束时间点），并计算两者时间差（渗出持续时 间）。
1.6 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；两组间比较采用独立样本t检验。计数资料组间比较采用秩和检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 支架材料相关观测
2.1.1 大体观察
蚕丝支架为双股蚕丝束螺旋缠绕而成；复合支架内为双股螺旋蚕丝束，外围膜状SIS呈圆筒状包绕。见图 1。
图1
支架材料大体观察 ⓐ 蚕丝支架 ⓑ 复合支架 2.1.2 生物力学性能测定
蚕丝支架和复合支架的最大载荷分别为（138.62±11.41）、（137.05±16.95） N，刚度分别为（24.65±2.62）、（24.21±2.39）N/mm，形变量分别为9.40、10.67，比较差异均无统计学意义（t=0.242，P=0.814；t=0.381，P=0.702；Z=0.493，P=0.622）。
2.2 支架材料细胞相容性评价
2.2.1 活死细胞染色观察
荧光显微镜观察示，蚕丝支架与复合支架上细胞以绿染的活细胞为主，红染死细胞极少，且活细胞形态良好，外形轮廓清晰；随着时间推移，两种支架材料上的活细胞密度逐渐增大，其中复合支架上BMSCs伸展性更好，细胞通过伪足相互连接成网状。见图 2。
2.2.2 CCK-8法检测细胞增殖活力
3组A值均随培养时间延长而升高，呈时间依赖性。各时间点A、B、C组A值比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图 3。
2.3 支架材料组织相容性评价
HE染色示，术后2周，SS组外围SIS降解不明显，4周时明显降解，8周时SIS降解完全。术后2、4、8周，两组均可见炎性细胞浸润，且随时间延长，浸润程度均呈逐渐减轻趋势；各时间点SS组炎性细胞数均少于S组，差异有统计学意义（P＜0.05）。
SS组术后2周新生血管极少，4周支架外缘可见较多新生血管形成，8周支架中间部分出现较多新生血管；而S组术后各时间点均未见明显新生血管。术后各时间点两组新生血管数比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 4及表 1。
表1
术后各时间点两组炎性细胞数及新生血管数比较（n=5，2.4 支架材料减缓胫骨隧道关节液渗入能力评价
2.4.1 电解液灌注后移植物电阻值测定
S组和SS组初始电阻值分别为（4 355.6±689.4）Ω和（3 466.7±412.3）Ω，饱和电阻值分别为（2 233.0± 193.6） Ω和（2 200.0 ± 327.9）Ω。
10%NaCl灌注后0 ～20 min内两组电阻值均未发生变化，20 min后S组电阻值急剧下降，至40 min时下降至（2 233.0 ± 227.1） Ω后达到平衡。而SS组于40 min后电阻值开始降低，下降较缓慢，80 min后降至（2 200.0±232.7） Ω，达到平衡。S组电阻值开始下降时间点为（20±3）min，SS组为（40±4）min，差异有统计学意义（t= -2.821，P=0.018）。SS组电阻值拟合曲线的斜率明显小于S组，差异有统计学意义（Z= -2.403，P=0.016）。见图 5。
图5
膝关节ACL重建后两组移植物电阻值变化曲线图
Figure5.
Curve graph of the electric resistance of the scaffold after ACL reconstruction
2.4.2 墨水灌注渗出时间观察
SS组墨水灌注渗出时间及流注时间均较S组明显延迟，时间差明显大于S组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。
表2
ACL重建术中S组与SS组墨水渗漏情况比较（n=10，s，3 讨论
为解决自体、同种异体以及人工韧带材料临床应用时存在的一些不足，组织工程韧带支架材料成为当前ACL重建支架研究的热点。在移植早期，新生韧带组织尚不具有相应力学性能时，需要移植物提供足够的力学支撑以保证膝关节稳定性，因此韧带组织工程支架要求材料的力学强度、弹性、硬度以及整体结构性优化结合[27]。基于以上考虑，本研究添加了易于编织且生物力学性能优异的脱胶蚕丝，通过螺旋结构的编织方法制备了最大载荷达（137.05±16.95）N、刚度达（24.21±2.39）N/mm的复合支架。结合文献报道[7, 28]的兔ACL破坏力约为40 N（兔体质量按2.5～3.0 kg计算），提示本研究体外构建的复合支架可在ACL重建早期提供足够的力学强度；同时蚕丝在体内降解慢[9, 29]，能够在移植后较长一段时间内提供合适的力学强度。本研究构建的复合支架可满足兔ACL重建的力学要求，为动物实验奠定了基础。
韧带移植物体内移植后主要经过移植物坏死降解、再细胞化及再血管化、组织重塑等过程[30]。在早期移植物未血管化之前，移植物坏死降解后，生物力学性能会迅速下降，因此移植早期支架血管化对于ACL重建至关重要[22]。支架早期血管化能促进支架内BMSCs、成纤维细胞等细胞的修复活动，加快后期体内韧带化过程[21-31]。本研究选择了移植后能促细胞化、血管化的SIS包绕蚕丝支架，以期使移植后支架表面能早期再血管化。这种设计模拟了正常韧带表面滑膜血管提供韧带血运的结构。本研究细胞增殖曲线及活死细胞染色结果表明，复合支架更有利于细胞黏附、增殖。同时皮下植入结果表明，术后各时间点复合支架的新生血管明显多于蚕丝支架，且复合支架从边缘到内部逐渐达到了血管化。
临床研究发现[32]，ACL重建后早期关节液中多种细胞因子水平升高，如基质金属蛋白酶、金属蛋白酶组织抑制剂、TNF-α和低密度白介素受体拮抗剂等，这些细胞因子使移植组织坏死范围扩大，影响移植物再血管化。也有研究[33]发现无关节滑液环境下的腱-骨愈合明显优于有关节滑液环境，说明关节滑液不利于ACL重建后腱-骨愈合。为减少关节滑液渗入骨隧道，临床ACL重建多采用保留残迹法[34]，本研究拟通过SIS包裹蚕丝构建的复合支架重建ACL，减少关节液渗入骨隧道。通过导电性能差别较大的两种不同电解质液对两种状态进行模拟定量，分别作渗漏状态下的初始电阻值以及渗液饱和状态下的电阻值，结果提示关节液渗漏过程的电阻值介于2 200.0～4 355.6 Ω之间，可认为渗出越多，支架体内重建后的电阻值越接近2 200.0 Ω。同时本研究模拟了关节液渗漏的极限状态，即在兔活体ACL重建后，关节内注射5 mL液体，使膝关节完全充盈后立即进行测试，并在测试过程中不断进行膝关节完全屈伸运动。通过电阻值变化与墨水渗出时间两个指标发现同一趋势：在极限状态下，蚕丝支架与复合支架重建兔ACL后，均有关节液渗入，但复合支架组关节液渗入胫骨隧道时间较蚕丝支架组明显推迟。
综上述，本研究制备的SIS-蚕丝复合支架具有良好的生物力学性能、细胞相容性与组织相容性，并能减缓兔ACL重建后关节液渗入胫骨隧道，有望成为一种良好的ACL重建材料。
前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）是维持膝关节稳定性的重要韧带，撕裂后自我修复能力较差，多数需要通过手术重建，以恢复膝关节稳定性。目前，临床常用的韧带移植物包括自体肌腱、同种异体移植物和人工韧带，但应用时存在损害人体正常组织、免疫排斥反应、潜在的疾病传播风险以及疲劳断裂等缺点[1-3]；此外，还存在重建后关节液渗入骨隧道影响腱-骨愈合[4-5]等问题。因此，寻找一种更理想的ACL重建移植物成为研究热点。蚕丝是一种天然生物材料，因其弹性和强度的理想结合以及具有良好的生物相容性，成为理想的韧带组织工程支架材料[6]。2002年，Altman等[6]研究表明蚕丝纤维能促进人BMSCs的增殖和分化，并上调韧带相关基因的表达。之后有研究通过在蚕丝支架内添加微孔蚕丝海绵[7-8]和复合Ⅰ型胶原[9]等方法改进蚕丝支架，于动物体内重建ACL后均达到了较好效 果。
小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）是一种天然的细胞外基质衍生材料，富含Ⅰ、Ⅲ型胶原[10]，并含有VEGF、FGF、TGF、EDGF等多种细胞活性因子[11]。SIS的生物相容性好、免疫原性低[12]，体内移植后能迅速诱导细胞浸润，刺激血管生成，使修复部位早期血管化，诱导特定部位的组织重塑[13-15]，在组织工程肌腱、软骨、骨膜、皮肤等领域[16-20]获得广泛应用。
韧带支架的早期血管化能为支架尽早提供血运，加速支架体内韧带化过程[21-22]。据此，本实验拟在蚕丝支架上添加能促进早期血管化的SIS，构建SIS-蚕丝复合支架，探究其生物力学性能和是否具有早期血管化能力，以及能否解决ACL重建后关节液渗入骨隧道造成腱-骨愈合不良的问题。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
28周龄雄性新西兰大白兔20只，体质量2.5～ 3.0 kg；6周龄雄性SD大鼠30只，体质量180～200 g；均由四川大学动物实验中心提供。
蚕丝（四川大学纺织学院）；新鲜猪小肠（成都肉联厂）；L-DMEM培养基、FBS、胰蛋白酶、人用淋巴细胞分离液（GIBCO公司，美国）；钙黄绿素（calcein-acetoxymethylester，Calcein-AM）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）（Sigma公司，美国）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8；株式会社同仁化学研究所，日本）。
液压式伺服动静态生物力学测试系统（Instron公司，美国）；Model X-630 型扫描电镜（Hitachi公司，日本）；CO2细胞培养箱（SANYO公司，日本）；超净工作台（Thermo公司，美国）；E600型荧光显微镜、TE2000-U型光学显微镜（Nikon公司，日本）；连续光谱微孔板测读仪（Molecular Devices公司，美国）；DT9205A数字万用表（HT公司，日本）。
1.2 支架材料制备及相关观测
1.2.1 SIS制备
参考文献[10]方法将新鲜猪小肠冲洗干净，剪成15 cm左右的小段，沿长轴剖开，用纱布包绕手术刀柄，刮除小肠黏膜层、肌层、浆膜层，将获得的黏膜下层依次经过脱脂、脱细胞、去病毒处理后冷冻，最后冻干备用。
1.2.2 蚕丝支架制备
将蚕丝缠绕固定于玻璃支架上，置于0.02 mol/L碳酸钠溶液中，100℃水浴1.5 h，完全脱去表面丝胶蛋白[23]；最后双蒸水冲洗10次，通风柜风干备用。脱胶后蚕丝以双蒸水润湿后缠绕于相距7 cm的固定针头两端，共缠绕40圈，将一端针头固定，另一端针头反方向旋转10圈，从中间折叠扭曲制成直径2 mm、长30 mm、具有螺旋结构的编织蚕丝束。蚕丝束两端分别用2根2-0涤纶线以锁边缝合法缝合编织成长10 cm的双股牵引线，风干，环氧乙烷灭菌备用。
1.2.3 复合支架制备
将SIS修剪成4 cm×2 cm的方形膜片，双蒸水润湿，包绕在蚕丝支架外围。用5-0滑线缝合固定SIS边缘，以维持外围SIS形成的圆筒状结构。再用2根2-0涤纶线锁边缝合复合支架两端，作为支架牵引线。
1.2.4 支架观察
① 大体观察：取双蒸水润湿后的蚕丝支架和复合支架，观察支架表面形态。② 生物力学性能测定：取蚕丝支架与复合支架用去离子水浸泡过夜，液压式伺服动静态生物力学测试系统夹具夹紧支架两端进行单轴拉力测试。加载速度10 mm/min，每组10个标本，连续记录并绘制载荷-位移曲线。依据载荷-位移曲线，计算最大载荷、形变量和刚度。
1.3 支架材料细胞相容性评价
1.3.1 兔BMSCs分离培养
参考文献[24-25]方法，通过密度梯度离心获取新西兰大白兔原代BMSCs，用含10%FBS的L-DMEM培养基培养，细胞生长融合至90%时，以胰蛋白酶消化传代，取第3代细胞冻存备用。
1.3.2 活死细胞染色观察
蚕丝脱胶后按文献[7]方法制成蚕丝海绵，以束状铺于6孔板孔底，作为蚕丝支架组；将SIS修剪制成直径为16 mm 的圆片置于6孔板孔底，其上再铺蚕丝海绵，作为复合支架组。每组设3个复孔，环氧乙烷灭菌。取培养的第3代兔BMSCs，以 1×105个/孔密度分别接种于两组材料上，在含10%FBS的L-DMEM 培养基中培养；分别于接种后1、5 d吸出培养基，PBS洗2遍，加入2 mL Calcein-AM/PI溶液，室温下避光染色30 min；PBS洗2遍，荧光显微镜下观察细胞形态及生长黏附情况，细胞绿染为活细胞，红染为死细胞。
1.3.3 CCK-8法检测细胞增殖活力
支架材料浸提液制备：根据GB/T16886.12标准规定的浸提比例（0.2 g/mL）[19]，将蚕丝支架、复合支架灭菌后浸泡于L-DMEM培养基中，37℃、5%CO2及饱和湿度细胞培养箱中浸提24 h，按照10%比例添加FBS制得蚕丝支架与复合支架浸提液。
取第3代兔BMSCs以2×103个/孔密度接种于96孔板中，于37℃、5%CO2及饱和湿度细胞培养箱中培养4 h，使细胞充分贴壁，弃原液。将细胞分别采用蚕丝支架浸提液（A组）、复合支架浸提液（B组）及正常细胞培养液（C组）培养，于0、1、3、5、7、9 d后每孔加110 μL CCK-8溶液，37℃、5%CO2及饱和湿度细胞培养箱中孵育3 h，采用酶标仪于450 nm波长下测量吸光度（A）值，并绘制细胞生长曲线。
1.4 支架材料组织相容性评价
将30只SD大鼠随机分为蚕丝支架组（S组）和复合支架组（SS组），每组15只。大鼠以腹腔注射10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）麻醉后背部去毛，无菌条件下于背部正中作纵切口，深至皮下筋膜层，向两边钝性分离皮下组织；切口两侧各植入2个1 cm长支架材料，缝合皮肤，正常分笼饲养。术后2、4、8 周每组各处死5只大鼠，取材行 HE染色观察材料组织相容性。每张切片于高倍镜（×400）下选取5个视野，计数各时间点炎性细胞（细胞核大、蓝染）和新生血管，并观察材料中SIS的降解情况。
1.5 支架材料减缓胫骨隧道关节液渗入能力评价
1.5.1 兔膝关节重建模型制备
取20只新西兰大白兔，每只均行双侧后肢ACL重建，左后肢为蚕丝支架重建组（S组），右后肢为复合支架重建组（SS组）。兔以耳缘静脉注射3%戊巴比妥（1.5 mL/kg）麻醉，双膝关节备皮。无菌条件下行髌骨内缘膝关节切开术，切开关节腔，切除部分髌下脂肪垫，暴露ACL，在股骨、胫骨韧带止点处完全切除ACL，用2.0 mm钻头在韧带止点处分别钻取股骨及胫骨隧道，沿牵引线将对应移植物拉入骨隧道，移植物末端用松质骨螺钉固定，屈曲30°拉紧移植物，拧紧两端螺钉。关节腔冲洗后逐层缝合，关闭切口。在ACL重建模型完成后即刻，于胫骨平台下1 cm处，在胫骨隧道前内侧作大小为1.0 cm×0.5 cm的骨窗，显露移植物，分别取10只动物用于电解液灌注后移植物电阻值测定和墨水灌注渗出时间测定。
1.5.2 电解液灌注后移植物电阻值测定
参照文献[26]方法，用生理盐水浸泡新鲜制备的蚕丝支架与复合支架1 min 后，用电阻仪分别测量两组支架上1 cm距离的电阻值，定为初始电阻。再将测量后的蚕丝支架与复合支架浸泡于10%NaCl溶液中1 min，再次测量电阻值，定为饱和电阻。将兔膝关节ACL重建模型固定于铁架台上，保持胫骨关节面与地面平行。将电阻仪正极置于骨窗最上端移植物表面，负极置于相距1 cm的下端移植物表面。向关节腔内缓慢注入10%NaCl溶液5 mL，于停止注射后0、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90 min测量电阻值。每个时间点完成测量后均屈伸膝关节3 次，每个时间点测量3次，取均值，并绘制电阻-时间曲线 图。
1.5.3 墨水灌注渗出时间观察
在500 mL生理盐水中注入5 mL碳素墨水，高温高压消毒，制成黑色生理盐水染液。兔膝关节ACL重建模型建立后，向兔关节腔内缓慢注入5 mL黑色生理盐水染液，每隔5 min屈伸膝关节3次。用相机录像模式记录渗出过程，观察墨水从骨窗开始渗出时间及流注时间（渗出结束时间点），并计算两者时间差（渗出持续时 间）。
1.6 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；两组间比较采用独立样本t检验。计数资料组间比较采用秩和检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 支架材料相关观测
2.1.1 大体观察
蚕丝支架为双股蚕丝束螺旋缠绕而成；复合支架内为双股螺旋蚕丝束，外围膜状SIS呈圆筒状包绕。见图 1。
图1
支架材料大体观察 ⓐ 蚕丝支架 ⓑ 复合支架 2.1.2 生物力学性能测定
蚕丝支架和复合支架的最大载荷分别为（138.62±11.41）、（137.05±16.95） N，刚度分别为（24.65±2.62）、（24.21±2.39）N/mm，形变量分别为9.40、10.67，比较差异均无统计学意义（t=0.242，P=0.814；t=0.381，P=0.702；Z=0.493，P=0.622）。
2.2 支架材料细胞相容性评价
2.2.1 活死细胞染色观察
荧光显微镜观察示，蚕丝支架与复合支架上细胞以绿染的活细胞为主，红染死细胞极少，且活细胞形态良好，外形轮廓清晰；随着时间推移，两种支架材料上的活细胞密度逐渐增大，其中复合支架上BMSCs伸展性更好，细胞通过伪足相互连接成网状。见图 2。
2.2.2 CCK-8法检测细胞增殖活力
3组A值均随培养时间延长而升高，呈时间依赖性。各时间点A、B、C组A值比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图 3。
2.3 支架材料组织相容性评价
HE染色示，术后2周，SS组外围SIS降解不明显，4周时明显降解，8周时SIS降解完全。术后2、4、8周，两组均可见炎性细胞浸润，且随时间延长，浸润程度均呈逐渐减轻趋势；各时间点SS组炎性细胞数均少于S组，差异有统计学意义（P＜0.05）。
SS组术后2周新生血管极少，4周支架外缘可见较多新生血管形成，8周支架中间部分出现较多新生血管；而S组术后各时间点均未见明显新生血管。术后各时间点两组新生血管数比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 4及表 1。
表1
术后各时间点两组炎性细胞数及新生血管数比较（n=5，2.4 支架材料减缓胫骨隧道关节液渗入能力评价
2.4.1 电解液灌注后移植物电阻值测定
S组和SS组初始电阻值分别为（4 355.6±689.4）Ω和（3 466.7±412.3）Ω，饱和电阻值分别为（2 233.0± 193.6） Ω和（2 200.0 ± 327.9）Ω。
10%NaCl灌注后0 ～20 min内两组电阻值均未发生变化，20 min后S组电阻值急剧下降，至40 min时下降至（2 233.0 ± 227.1） Ω后达到平衡。而SS组于40 min后电阻值开始降低，下降较缓慢，80 min后降至（2 200.0±232.7） Ω，达到平衡。S组电阻值开始下降时间点为（20±3）min，SS组为（40±4）min，差异有统计学意义（t= -2.821，P=0.018）。SS组电阻值拟合曲线的斜率明显小于S组，差异有统计学意义（Z= -2.403，P=0.016）。见图 5。
图5
膝关节ACL重建后两组移植物电阻值变化曲线图
Figure5.
Curve graph of the electric resistance of the scaffold after ACL reconstruction
2.4.2 墨水灌注渗出时间观察
SS组墨水灌注渗出时间及流注时间均较S组明显延迟，时间差明显大于S组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。
表2
ACL重建术中S组与SS组墨水渗漏情况比较（n=10，s，3 讨论
为解决自体、同种异体以及人工韧带材料临床应用时存在的一些不足，组织工程韧带支架材料成为当前ACL重建支架研究的热点。在移植早期，新生韧带组织尚不具有相应力学性能时，需要移植物提供足够的力学支撑以保证膝关节稳定性，因此韧带组织工程支架要求材料的力学强度、弹性、硬度以及整体结构性优化结合[27]。基于以上考虑，本研究添加了易于编织且生物力学性能优异的脱胶蚕丝，通过螺旋结构的编织方法制备了最大载荷达（137.05±16.95）N、刚度达（24.21±2.39）N/mm的复合支架。结合文献报道[7, 28]的兔ACL破坏力约为40 N（兔体质量按2.5～3.0 kg计算），提示本研究体外构建的复合支架可在ACL重建早期提供足够的力学强度；同时蚕丝在体内降解慢[9, 29]，能够在移植后较长一段时间内提供合适的力学强度。本研究构建的复合支架可满足兔ACL重建的力学要求，为动物实验奠定了基础。
韧带移植物体内移植后主要经过移植物坏死降解、再细胞化及再血管化、组织重塑等过程[30]。在早期移植物未血管化之前，移植物坏死降解后，生物力学性能会迅速下降，因此移植早期支架血管化对于ACL重建至关重要[22]。支架早期血管化能促进支架内BMSCs、成纤维细胞等细胞的修复活动，加快后期体内韧带化过程[21-31]。本研究选择了移植后能促细胞化、血管化的SIS包绕蚕丝支架，以期使移植后支架表面能早期再血管化。这种设计模拟了正常韧带表面滑膜血管提供韧带血运的结构。本研究细胞增殖曲线及活死细胞染色结果表明，复合支架更有利于细胞黏附、增殖。同时皮下植入结果表明，术后各时间点复合支架的新生血管明显多于蚕丝支架，且复合支架从边缘到内部逐渐达到了血管化。
临床研究发现[32]，ACL重建后早期关节液中多种细胞因子水平升高，如基质金属蛋白酶、金属蛋白酶组织抑制剂、TNF-α和低密度白介素受体拮抗剂等，这些细胞因子使移植组织坏死范围扩大，影响移植物再血管化。也有研究[33]发现无关节滑液环境下的腱-骨愈合明显优于有关节滑液环境，说明关节滑液不利于ACL重建后腱-骨愈合。为减少关节滑液渗入骨隧道，临床ACL重建多采用保留残迹法[34]，本研究拟通过SIS包裹蚕丝构建的复合支架重建ACL，减少关节液渗入骨隧道。通过导电性能差别较大的两种不同电解质液对两种状态进行模拟定量，分别作渗漏状态下的初始电阻值以及渗液饱和状态下的电阻值，结果提示关节液渗漏过程的电阻值介于2 200.0～4 355.6 Ω之间，可认为渗出越多，支架体内重建后的电阻值越接近2 200.0 Ω。同时本研究模拟了关节液渗漏的极限状态，即在兔活体ACL重建后，关节内注射5 mL液体，使膝关节完全充盈后立即进行测试，并在测试过程中不断进行膝关节完全屈伸运动。通过电阻值变化与墨水渗出时间两个指标发现同一趋势：在极限状态下，蚕丝支架与复合支架重建兔ACL后，均有关节液渗入，但复合支架组关节液渗入胫骨隧道时间较蚕丝支架组明显推迟。
综上述，本研究制备的SIS-蚕丝复合支架具有良好的生物力学性能、细胞相容性与组织相容性，并能减缓兔ACL重建后关节液渗入胫骨隧道，有望成为一种良好的ACL重建材料。
