引用本文： 周建新, 杨晓斐, 李阳, 丁朋, 蒋逸秋, 桂鉴超. 软骨前体细胞的分离鉴定及IL-1β对其成软骨分化的影响. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(7): 863-869. doi: 10.7507/1002-1892.20150187 复制
关节软骨由于自身组织无血管，其自身修复能力极为有限[1-2]，一旦损伤往往会遗留疼痛或功能障碍，最后易致关节退变及骨性关节炎[3]。目前，临床上对关节软骨损伤的主要治疗方法有骨髓刺激技术（以微骨折术为代表[4-5]）、骨软骨移植技术（以马赛克技术为代表[6]）等，但结果均不令人满意。组织工程学技术的兴起令人们再次看到软骨修复的希望。组织工程学涉及种子细胞、支架材料、生长因子3个主要因素。自体软骨细胞移植已在临床上应用[7]，但体外培养的软骨细胞很容易发生去分化 [8-9]，而且得到的修复组织只能是纤维软骨，而不是正常透明软骨。BMSCs也曾被用作软骨损伤修复的种子细胞，但其来源于骨髓而不是软骨组织本身，并且具有自发向成骨分化的倾向，即使在体外诱导软骨分化条件下，合成的基质仍主要是Ⅰ型胶原。近年来软骨前体细胞的发现可能为我们揭示了早期软骨损伤修复的本质[10-12]，目前对其研究已成为热点[13-14]，但国内仍鲜有这方面报道。
软骨在损伤后的修复过程中，细胞均处于一种炎性环境，炎性因子的释放可能是导致软骨损伤后修复困难的因素。近年来，人们对细胞外支架进行了许多研究，试图通过改良支架来减轻炎性因子对植入种子细胞的抑制作用[15-16]；也有研究直接探讨炎性因子对BMSCs、脂肪干细胞增殖、分化的影响[17-19]，以期减轻这种不利影响。Joos等[20]研究表明IL-1β对软骨前体细胞的迁移有抑制作用。但目前尚未见关于IL-1β对软骨前体细胞分化影响的研究。本研究从正常软骨组织中消化并通过纤连蛋白粘连实验分离出软骨前体细胞，进行流式细胞鉴定、三系分化，并揭示不同浓度IL-1β对软骨前体细胞向软骨细胞分化的影响，以期为软骨前体细胞在炎性环境下进行软骨修复的研究奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康5月龄雄性新西兰大白兔1只，体重3.1 kg，由南京医科大学附属南京医院动物实验中心所提供。动物饲养于昼夜循环、无限量水和食物供应的动物设施中；实验方案经南京医科大学附属南京医院伦理委员会批准。
Ⅱ型胶原抗体（Acris公司，美国）；纤连蛋白（GIBCO公司，美国）；IL-1β、TNF-α（Perprotech公司，美国）；成骨诱导分化培养基、成脂诱导分化培养基（Cyagen Bioscience公司，美国）；TGF-β3（Life公司，美国）；Ⅹ型胶原抗体、CD34、CD45、CD90、CD105、CD49e（Abcam公司，英国）；Hoechst 33258染料（Anaspec公司，美国）；Trizol （Invitrogen公司，美国）；cDNA第1链合成试剂盒（Fermentas公司，立陶宛）；OneStep SYBR® PrimerScript® RT-PCR试剂盒（Takara公司，日本）。
MCO-20AIC CO2培养箱（SANYO公司，日本）；
SW-CJ-1FB超净台（苏州净化设备有限公司）；BX53倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；LDZX-75KB立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；FACS Calibur流式细胞仪（BD公司，美国）；Model1680酶联免疫检测仪（Bio-Rad公司，美国）；DA7600荧光定量PCR循环仪（中山大学达安基因股份有限公司）。
1.2 软骨前体细胞的分离培养及相关观测
1.2.1 软骨前体细胞的分离培养
取新西兰大白兔后肢膝关节面软骨组织，用Ⅱ型胶原酶消化分离得到软骨细胞[20]。将含软骨细胞的DMEM培养液平均分配至处理好的培养皿（培养皿底部在实验前1 d涂一层含10 mg/mL纤连蛋白、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L CaCl2的PBS液，并于4℃中过夜），放入37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养20 min；然后移除培养液及未粘连的细胞，在培养皿中加入适量含10%FBS的DMEM培养液，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，每3天换液1次，细胞在培养皿中生长至80%～90%融合时传代。
1.2.2 流式细胞仪鉴定
取第3代生长良好的细胞，用0.02%EDTA-0.05%胰蛋白酶消化3 min，加入含10%FBS的DMEM培养液终止消化，收集细胞悬液至离心管，离心洗涤2次（每次均以1 500×g离心5 min），制成单细胞悬液。任选一管不加任何标记作为空白对照，其余数管分别加入FITC标记的CD34、CD45、CD90、CD105、CD49e。4℃条件下孵育1 h，PBS洗涤，多聚甲醛固定，上流式细胞仪分析。
1.2.3 细胞生长情况观察
取第3代软骨前体细胞单层培养，将1 000个细胞接种于培养皿中，加入含10%FBS的DMEM培养液，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，每3天换液1次，培养15 d，倒置相差显微镜观察软骨前体细胞生长情况。
1.2.4 软骨前体细胞的三系分化检测
① 成骨细胞分化与鉴定：将第3代软骨前体细胞在成骨诱导分化培养基（含10%FBS、80 U/mL青霉素、0.08 mg/mL链霉素、10 mmol/mL β-甘油磷脂钠、100 nmol/L地塞米松、0.1 mmol/L抗坏血酸磷酸盐的H-DMEM培养基）培养，每周2次换全液，3周后4%甲醛固定，行茜素红染色鉴定。
② 成脂肪细胞分化与鉴定：待第3代软骨前体细胞接近完全融合时，继续用含10%FBS的DMEM培养液培养3～7 d，然后用成脂诱导分化培养基（含1.0 μmol/mL地塞米松、0.5 mmol/mL 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、100 μmol/mL吲哚美辛、10 mg/L胰岛素的H-DMEM培养基）培养48 h后，换液继续培养48 h；再用成脂肪细胞维持体系（含10%FBS、10 mg/ L胰岛素的H-DMEM培养基）继续培养1周，吸除培养皿底部培养液，PBS洗涤细胞3次后加入4%多聚甲醛室温下固定60 min，70%乙醇洗涤。油红O染色后光镜下观察成脂肪细胞分化情况。
③ 成软骨细胞分化与鉴定：取第3代生长良好的软骨前体细胞，用0.02%EDTA-0.05%胰蛋白酶消化3 min，后加入含10%FBS的DMEM培养液终止消化，收集细胞悬液至离心管，以1 500×g离心5 min；弃上清液，同上法离心洗涤2次；然后用生理盐水稀释成1×105 个 / mL，取5 mL置入15 mL离心管中，以2 000×g离心5 min，小心移除上清液，细胞沉聚于离心管底部。在含细胞团块的离心管中沿管壁缓慢注入成软骨诱导分化培养基（含80 U/ mL青霉素、0.08 mg/mL链霉素、10 μg/mL胰岛素、5.5 μg/ mL转铁蛋白、5 ng/ mL硒、0.1 μmol/mL地塞米松、 50 μg/ mL L-抗坏血酸、40 μg/mL脯氨酸、100 μg/mL丙酮酸、2.5 ng/ mL TGF-β3的H-DMEM培养基）5 mL，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养24 h；细胞团块悬起，每2～3天换全液，3周后细胞团块呈软骨样组织。取该组织甲醛固定，作组织学切片（片厚5 μm），行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定。
1.3 不同浓度IL-1β对软骨前体细胞成软骨分化的影响
根据使用的培养基不同将实验分为4组，A组为普通DMEM培养基，B组为成软骨诱导分化培养基，C组为成软骨诱导分化培养基+0.1 ng/mL IL-1β，D组为成软骨诱导分化培养基+1.0 ng/mL IL-1β。取软骨前体细胞，分别放入各组相应培养基中，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养24 h，每3天换全液，3周后进行以下观测。
1.3.1 组织学及免疫组织化学染色观察
取各组细胞团块，10%甲醛固定，石蜡包埋，制作石蜡切片（片厚5 μm）。常规行HE染色、番红O染色及Ⅱ型胶原和Ⅹ型胶原免疫组织化学染色观察。
1.3.2 生物化学成分测定
各组取20 mg组织标本，酶标仪上于656 nm波长下检测糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）相对含量，555 nm波长下检测总胶原相对含量，260 nm波长下检测DNA相对含量[21]，并计算GAG/DNA比值。
1.3.3 实时荧光定量PCR检测基因表达
用Trizol试剂提取各组软骨组织中的总RNA，利用OneStep SYBR® PrimeScript® RT-PCR试剂盒检测Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、Sox-9、Runx-2、基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）软骨相关基因的表达，GAPDH为看家基因。各基因引物序列见表 1。以2-ΔΔCt法检测各基因相对表达量，每个样本设3个复孔。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of genes
1.4 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 软骨前体细胞的分离培养及相关观测
2.1.1 流式细胞仪鉴定
流式细胞仪检测示，所培养细胞CD34（1.7%±0.2%）、CD45（2.6%±0.3%）呈阴性表达，CD90（91.0%±1.1%）、CD105（92.7%±1.1%）呈阳性表达，CD49e（96.7%±0.9%）呈高阳性表达。
2.1.2 软骨前体细胞生长情况观察
倒置相差显微镜观察示，软骨前体细胞呈现与干细胞相似的梭形形态，呈明显集落样克隆生长（图 1），并且整个细胞集落随时间推移逐渐增大。
图1
软骨前体细胞形态学观察（倒置相差显微镜×100） 2.1.3 软骨前体细胞三系分化鉴定
茜素红染色示成骨分化细胞被染成红色；油红O染色示成脂分化细胞出现红染的脂肪滴；Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性表现，成软骨分化细胞细胞质及细胞外基质呈黄色。见图 2。
2.2 不同浓度IL-1β对软骨前体细胞分化的影响
2.2.1 组织学和免疫组织化学染色观察
① HE染色示，B组细胞团块明显大于A组，C、D组明显小于A组。A组中呈类圆形并生长于软骨陷凹中的细胞明显少于B组，而C、D组中可见较多肥大样细胞，且D组肥大样细胞多于C组，各组细胞密度未见明显异常。② 番红O染色示，B组红染明显深于A组，C、D组红染均浅于B组，且D组浅于C组。③ Ⅱ型胶原及Ⅹ型胶原免疫组织化学染色示，B组染色均深于A组，C、D组染色均浅于B组，且D组浅于C组。见图 3～6。
图5
各组细胞团块Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察（×100） ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 ⓓ D组 图 6 各组细胞团块Ⅹ型胶原免疫组织化学染色观察（×100） ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 ⓓ D组
Figure5.
Expressions of collagen type II with immunohistochemical staining (×100) ⓐ Group A ⓑ Group B ⓒ Group C ⓓ Group D Fig. 6 Expressions of collagen type X with immunohistochemical staining (×100) ⓐ Group A ⓑ Group B ⓒ Group C ⓓ Group D
2.2.2 生物化学成分测定
B组细胞外基质中GAG、总胶原相对含量及GAG/DNA比值均显著高于A组，C、D组显著低于B组，D组显著低于C组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。B组DNA相对含量则明显低于A组，C、D组明显高于B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；而C、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表 2。
表2
各组细胞团块生物化学成分测定（n=3，2.2.3 实时荧光定量PCR检测
B组Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、Sox-9 mRNA相对表达量均显著高于A组，C、D组显著低于B组，D组显著低于C组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。而B组Runx-2和MMP-13 mRNA相对表达量均显著低于A组，C、D组显著高于B组，D组显著高于C组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 3。
表3
实时荧光定量PCR检测各基因相对表达量
Table3.
Relative mRNA expressions of genes by real-time fluorescence quantitative PCR
3 讨论
软骨前体细胞作为组织工程软骨修复的种子细胞，已得到广泛关注[22]。本研究中，我们在兔正常软骨细胞中通过纤连蛋白粘连分离出软骨前体细胞。通过流式细胞仪细胞表型特征鉴定发现，软骨前体细胞对CD34、CD45阴性表达可排除其造血系来源，对CD90、CD105均为阳性表达；这些特征均与2006年国际细胞移植学会对BMSCs的标准定义相似[23]，表现出干细胞的特征。但软骨前体细胞对CD49e表现出高阳性特征，这可能是其特征性的一个标记[24]。在软骨前体细胞的单克隆增殖培养中，细胞呈集落样团簇生长，集落随时间推移不断增大，也反映出其单克隆特性。并且在其三系分化实验中，我们发现软骨前体细胞在不同培养基中可顺利向成软骨、成脂、成骨细胞分化。以上实验揭示了软骨前体细胞有与干细胞的自我克隆增殖相似的特性，是位于软骨组织内的原始细胞，它具有自我增殖的能力。由于其自然存在于软骨组织中，并具有自发向软骨分化的潜能[25]，可能在软骨受损时，比BMSCs、脂肪干细胞、滑膜干细胞[22, 26]更容易迁移至受损部位进行修复。因此，软骨细胞在软骨受损的修复过程中起着有限作用，而软骨前体细胞则可能担当了主要修复者的角色。
既往研究发现，软骨损伤后修复效果差与其炎性环境有关[27]，临床上也已用抗炎性介质药物来减轻炎性介质对软骨损伤后修复的抑制作用[28]。在IL-1β对软骨前体细胞成软骨分化影响的研究中，我们发现软骨前体细胞经成软骨诱导分化培养基诱导后，总胶原、GAG等细胞外基质成分合成均明显增加，在组织学上有更多细胞呈软骨细胞样生长于软骨陷凹中。然而IL-1β对细胞团块中Ⅱ型胶原、GAG有明显抑制作用，并且随IL-1β的浓度增高，抑制作用明显增强。这种作用在Ⅱ型胶原mRNA相对表达量的检测中也得到验证，因此我们认为IL-1β对Ⅱ型胶原的抑制作用是在合成水平进行抑制。MMP-13对Ⅱ型胶原有分解作用，而MMP-13在加入IL-1β的C、D组实时荧光定量PCR检测中升高明显，表明IL-1β对Ⅱ型胶原在细胞外的分解中起促进作用。IL-1β促使软骨前体细胞在分化过程中对Ⅱ型胶原合成减少及分解增加的共同作用，使得细胞外基质Ⅱ型胶原含量下降。在对C、D组的检测中发现，Sox-9作为一个必要的成软骨转录因子[29]，其含量随IL-1β浓度增高而明显降低，Runx-2则表现出相反趋势，表明IL-1β对持续诱导的软骨前体细胞的成软骨分化有明显抑制作用，并且呈一定的浓度相关性。我们在组织学检测中发现，IL-1β使持续诱导的软骨前体细胞出现明显肥大样改变，这种细胞形态与软骨细胞成骨时的肥大比较相似。由此我们推测，IL-1β对软骨前体细胞的持续成软骨诱导分化有抑制作用，并且有促进肥大的趋势，进而提示有成骨分化可能，这与骨性关节炎患者的骨赘形成有相似之处[30]。
综上述，本研究结果显示，在正常软骨中存在一种有干细胞特性的软骨前体细胞，并且有克隆和潜在分化能力；IL-1β对软骨前体细胞的成软骨分化有抑制作用，并有促进成骨的可能。但我们的研究仍有不足之处：对软骨前体细胞的分离是在正常软骨中进行的，而在急性或慢性损伤的软骨中未对其中软骨前体细胞的生物学特性进一步研究。我们在炎性介质对软骨前体细胞的分化影响研究中，仅取了 IL-1β 在0.1、1.0 ng/mL两个浓度以及在3周时间点进行检测，未进行更多浓度和时间点的研究，并且对另一重要炎性介质TNF-β未做相关实验。下一步将对以上方面进行相应的深入研究。
关节软骨由于自身组织无血管，其自身修复能力极为有限[1-2]，一旦损伤往往会遗留疼痛或功能障碍，最后易致关节退变及骨性关节炎[3]。目前，临床上对关节软骨损伤的主要治疗方法有骨髓刺激技术（以微骨折术为代表[4-5]）、骨软骨移植技术（以马赛克技术为代表[6]）等，但结果均不令人满意。组织工程学技术的兴起令人们再次看到软骨修复的希望。组织工程学涉及种子细胞、支架材料、生长因子3个主要因素。自体软骨细胞移植已在临床上应用[7]，但体外培养的软骨细胞很容易发生去分化 [8-9]，而且得到的修复组织只能是纤维软骨，而不是正常透明软骨。BMSCs也曾被用作软骨损伤修复的种子细胞，但其来源于骨髓而不是软骨组织本身，并且具有自发向成骨分化的倾向，即使在体外诱导软骨分化条件下，合成的基质仍主要是Ⅰ型胶原。近年来软骨前体细胞的发现可能为我们揭示了早期软骨损伤修复的本质[10-12]，目前对其研究已成为热点[13-14]，但国内仍鲜有这方面报道。
软骨在损伤后的修复过程中，细胞均处于一种炎性环境，炎性因子的释放可能是导致软骨损伤后修复困难的因素。近年来，人们对细胞外支架进行了许多研究，试图通过改良支架来减轻炎性因子对植入种子细胞的抑制作用[15-16]；也有研究直接探讨炎性因子对BMSCs、脂肪干细胞增殖、分化的影响[17-19]，以期减轻这种不利影响。Joos等[20]研究表明IL-1β对软骨前体细胞的迁移有抑制作用。但目前尚未见关于IL-1β对软骨前体细胞分化影响的研究。本研究从正常软骨组织中消化并通过纤连蛋白粘连实验分离出软骨前体细胞，进行流式细胞鉴定、三系分化，并揭示不同浓度IL-1β对软骨前体细胞向软骨细胞分化的影响，以期为软骨前体细胞在炎性环境下进行软骨修复的研究奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康5月龄雄性新西兰大白兔1只，体重3.1 kg，由南京医科大学附属南京医院动物实验中心所提供。动物饲养于昼夜循环、无限量水和食物供应的动物设施中；实验方案经南京医科大学附属南京医院伦理委员会批准。
Ⅱ型胶原抗体（Acris公司，美国）；纤连蛋白（GIBCO公司，美国）；IL-1β、TNF-α（Perprotech公司，美国）；成骨诱导分化培养基、成脂诱导分化培养基（Cyagen Bioscience公司，美国）；TGF-β3（Life公司，美国）；Ⅹ型胶原抗体、CD34、CD45、CD90、CD105、CD49e（Abcam公司，英国）；Hoechst 33258染料（Anaspec公司，美国）；Trizol （Invitrogen公司，美国）；cDNA第1链合成试剂盒（Fermentas公司，立陶宛）；OneStep SYBR® PrimerScript® RT-PCR试剂盒（Takara公司，日本）。
MCO-20AIC CO2培养箱（SANYO公司，日本）；
SW-CJ-1FB超净台（苏州净化设备有限公司）；BX53倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；LDZX-75KB立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；FACS Calibur流式细胞仪（BD公司，美国）；Model1680酶联免疫检测仪（Bio-Rad公司，美国）；DA7600荧光定量PCR循环仪（中山大学达安基因股份有限公司）。
1.2 软骨前体细胞的分离培养及相关观测
1.2.1 软骨前体细胞的分离培养
取新西兰大白兔后肢膝关节面软骨组织，用Ⅱ型胶原酶消化分离得到软骨细胞[20]。将含软骨细胞的DMEM培养液平均分配至处理好的培养皿（培养皿底部在实验前1 d涂一层含10 mg/mL纤连蛋白、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L CaCl2的PBS液，并于4℃中过夜），放入37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养20 min；然后移除培养液及未粘连的细胞，在培养皿中加入适量含10%FBS的DMEM培养液，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，每3天换液1次，细胞在培养皿中生长至80%～90%融合时传代。
1.2.2 流式细胞仪鉴定
取第3代生长良好的细胞，用0.02%EDTA-0.05%胰蛋白酶消化3 min，加入含10%FBS的DMEM培养液终止消化，收集细胞悬液至离心管，离心洗涤2次（每次均以1 500×g离心5 min），制成单细胞悬液。任选一管不加任何标记作为空白对照，其余数管分别加入FITC标记的CD34、CD45、CD90、CD105、CD49e。4℃条件下孵育1 h，PBS洗涤，多聚甲醛固定，上流式细胞仪分析。
1.2.3 细胞生长情况观察
取第3代软骨前体细胞单层培养，将1 000个细胞接种于培养皿中，加入含10%FBS的DMEM培养液，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，每3天换液1次，培养15 d，倒置相差显微镜观察软骨前体细胞生长情况。
1.2.4 软骨前体细胞的三系分化检测
① 成骨细胞分化与鉴定：将第3代软骨前体细胞在成骨诱导分化培养基（含10%FBS、80 U/mL青霉素、0.08 mg/mL链霉素、10 mmol/mL β-甘油磷脂钠、100 nmol/L地塞米松、0.1 mmol/L抗坏血酸磷酸盐的H-DMEM培养基）培养，每周2次换全液，3周后4%甲醛固定，行茜素红染色鉴定。
② 成脂肪细胞分化与鉴定：待第3代软骨前体细胞接近完全融合时，继续用含10%FBS的DMEM培养液培养3～7 d，然后用成脂诱导分化培养基（含1.0 μmol/mL地塞米松、0.5 mmol/mL 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、100 μmol/mL吲哚美辛、10 mg/L胰岛素的H-DMEM培养基）培养48 h后，换液继续培养48 h；再用成脂肪细胞维持体系（含10%FBS、10 mg/ L胰岛素的H-DMEM培养基）继续培养1周，吸除培养皿底部培养液，PBS洗涤细胞3次后加入4%多聚甲醛室温下固定60 min，70%乙醇洗涤。油红O染色后光镜下观察成脂肪细胞分化情况。
③ 成软骨细胞分化与鉴定：取第3代生长良好的软骨前体细胞，用0.02%EDTA-0.05%胰蛋白酶消化3 min，后加入含10%FBS的DMEM培养液终止消化，收集细胞悬液至离心管，以1 500×g离心5 min；弃上清液，同上法离心洗涤2次；然后用生理盐水稀释成1×105 个 / mL，取5 mL置入15 mL离心管中，以2 000×g离心5 min，小心移除上清液，细胞沉聚于离心管底部。在含细胞团块的离心管中沿管壁缓慢注入成软骨诱导分化培养基（含80 U/ mL青霉素、0.08 mg/mL链霉素、10 μg/mL胰岛素、5.5 μg/ mL转铁蛋白、5 ng/ mL硒、0.1 μmol/mL地塞米松、 50 μg/ mL L-抗坏血酸、40 μg/mL脯氨酸、100 μg/mL丙酮酸、2.5 ng/ mL TGF-β3的H-DMEM培养基）5 mL，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养24 h；细胞团块悬起，每2～3天换全液，3周后细胞团块呈软骨样组织。取该组织甲醛固定，作组织学切片（片厚5 μm），行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定。
1.3 不同浓度IL-1β对软骨前体细胞成软骨分化的影响
根据使用的培养基不同将实验分为4组，A组为普通DMEM培养基，B组为成软骨诱导分化培养基，C组为成软骨诱导分化培养基+0.1 ng/mL IL-1β，D组为成软骨诱导分化培养基+1.0 ng/mL IL-1β。取软骨前体细胞，分别放入各组相应培养基中，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养24 h，每3天换全液，3周后进行以下观测。
1.3.1 组织学及免疫组织化学染色观察
取各组细胞团块，10%甲醛固定，石蜡包埋，制作石蜡切片（片厚5 μm）。常规行HE染色、番红O染色及Ⅱ型胶原和Ⅹ型胶原免疫组织化学染色观察。
1.3.2 生物化学成分测定
各组取20 mg组织标本，酶标仪上于656 nm波长下检测糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）相对含量，555 nm波长下检测总胶原相对含量，260 nm波长下检测DNA相对含量[21]，并计算GAG/DNA比值。
1.3.3 实时荧光定量PCR检测基因表达
用Trizol试剂提取各组软骨组织中的总RNA，利用OneStep SYBR® PrimeScript® RT-PCR试剂盒检测Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、Sox-9、Runx-2、基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）软骨相关基因的表达，GAPDH为看家基因。各基因引物序列见表 1。以2-ΔΔCt法检测各基因相对表达量，每个样本设3个复孔。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of genes
1.4 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 软骨前体细胞的分离培养及相关观测
2.1.1 流式细胞仪鉴定
流式细胞仪检测示，所培养细胞CD34（1.7%±0.2%）、CD45（2.6%±0.3%）呈阴性表达，CD90（91.0%±1.1%）、CD105（92.7%±1.1%）呈阳性表达，CD49e（96.7%±0.9%）呈高阳性表达。
2.1.2 软骨前体细胞生长情况观察
倒置相差显微镜观察示，软骨前体细胞呈现与干细胞相似的梭形形态，呈明显集落样克隆生长（图 1），并且整个细胞集落随时间推移逐渐增大。
图1
软骨前体细胞形态学观察（倒置相差显微镜×100） 2.1.3 软骨前体细胞三系分化鉴定
茜素红染色示成骨分化细胞被染成红色；油红O染色示成脂分化细胞出现红染的脂肪滴；Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性表现，成软骨分化细胞细胞质及细胞外基质呈黄色。见图 2。
2.2 不同浓度IL-1β对软骨前体细胞分化的影响
2.2.1 组织学和免疫组织化学染色观察
① HE染色示，B组细胞团块明显大于A组，C、D组明显小于A组。A组中呈类圆形并生长于软骨陷凹中的细胞明显少于B组，而C、D组中可见较多肥大样细胞，且D组肥大样细胞多于C组，各组细胞密度未见明显异常。② 番红O染色示，B组红染明显深于A组，C、D组红染均浅于B组，且D组浅于C组。③ Ⅱ型胶原及Ⅹ型胶原免疫组织化学染色示，B组染色均深于A组，C、D组染色均浅于B组，且D组浅于C组。见图 3～6。
图5
各组细胞团块Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察（×100） ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 ⓓ D组 图 6 各组细胞团块Ⅹ型胶原免疫组织化学染色观察（×100） ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 ⓓ D组
Figure5.
Expressions of collagen type II with immunohistochemical staining (×100) ⓐ Group A ⓑ Group B ⓒ Group C ⓓ Group D Fig. 6 Expressions of collagen type X with immunohistochemical staining (×100) ⓐ Group A ⓑ Group B ⓒ Group C ⓓ Group D
2.2.2 生物化学成分测定
B组细胞外基质中GAG、总胶原相对含量及GAG/DNA比值均显著高于A组，C、D组显著低于B组，D组显著低于C组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。B组DNA相对含量则明显低于A组，C、D组明显高于B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；而C、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表 2。
表2
各组细胞团块生物化学成分测定（n=3，2.2.3 实时荧光定量PCR检测
B组Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、Sox-9 mRNA相对表达量均显著高于A组，C、D组显著低于B组，D组显著低于C组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。而B组Runx-2和MMP-13 mRNA相对表达量均显著低于A组，C、D组显著高于B组，D组显著高于C组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 3。
表3
实时荧光定量PCR检测各基因相对表达量
Table3.
Relative mRNA expressions of genes by real-time fluorescence quantitative PCR
3 讨论
软骨前体细胞作为组织工程软骨修复的种子细胞，已得到广泛关注[22]。本研究中，我们在兔正常软骨细胞中通过纤连蛋白粘连分离出软骨前体细胞。通过流式细胞仪细胞表型特征鉴定发现，软骨前体细胞对CD34、CD45阴性表达可排除其造血系来源，对CD90、CD105均为阳性表达；这些特征均与2006年国际细胞移植学会对BMSCs的标准定义相似[23]，表现出干细胞的特征。但软骨前体细胞对CD49e表现出高阳性特征，这可能是其特征性的一个标记[24]。在软骨前体细胞的单克隆增殖培养中，细胞呈集落样团簇生长，集落随时间推移不断增大，也反映出其单克隆特性。并且在其三系分化实验中，我们发现软骨前体细胞在不同培养基中可顺利向成软骨、成脂、成骨细胞分化。以上实验揭示了软骨前体细胞有与干细胞的自我克隆增殖相似的特性，是位于软骨组织内的原始细胞，它具有自我增殖的能力。由于其自然存在于软骨组织中，并具有自发向软骨分化的潜能[25]，可能在软骨受损时，比BMSCs、脂肪干细胞、滑膜干细胞[22, 26]更容易迁移至受损部位进行修复。因此，软骨细胞在软骨受损的修复过程中起着有限作用，而软骨前体细胞则可能担当了主要修复者的角色。
既往研究发现，软骨损伤后修复效果差与其炎性环境有关[27]，临床上也已用抗炎性介质药物来减轻炎性介质对软骨损伤后修复的抑制作用[28]。在IL-1β对软骨前体细胞成软骨分化影响的研究中，我们发现软骨前体细胞经成软骨诱导分化培养基诱导后，总胶原、GAG等细胞外基质成分合成均明显增加，在组织学上有更多细胞呈软骨细胞样生长于软骨陷凹中。然而IL-1β对细胞团块中Ⅱ型胶原、GAG有明显抑制作用，并且随IL-1β的浓度增高，抑制作用明显增强。这种作用在Ⅱ型胶原mRNA相对表达量的检测中也得到验证，因此我们认为IL-1β对Ⅱ型胶原的抑制作用是在合成水平进行抑制。MMP-13对Ⅱ型胶原有分解作用，而MMP-13在加入IL-1β的C、D组实时荧光定量PCR检测中升高明显，表明IL-1β对Ⅱ型胶原在细胞外的分解中起促进作用。IL-1β促使软骨前体细胞在分化过程中对Ⅱ型胶原合成减少及分解增加的共同作用，使得细胞外基质Ⅱ型胶原含量下降。在对C、D组的检测中发现，Sox-9作为一个必要的成软骨转录因子[29]，其含量随IL-1β浓度增高而明显降低，Runx-2则表现出相反趋势，表明IL-1β对持续诱导的软骨前体细胞的成软骨分化有明显抑制作用，并且呈一定的浓度相关性。我们在组织学检测中发现，IL-1β使持续诱导的软骨前体细胞出现明显肥大样改变，这种细胞形态与软骨细胞成骨时的肥大比较相似。由此我们推测，IL-1β对软骨前体细胞的持续成软骨诱导分化有抑制作用，并且有促进肥大的趋势，进而提示有成骨分化可能，这与骨性关节炎患者的骨赘形成有相似之处[30]。
综上述，本研究结果显示，在正常软骨中存在一种有干细胞特性的软骨前体细胞，并且有克隆和潜在分化能力；IL-1β对软骨前体细胞的成软骨分化有抑制作用，并有促进成骨的可能。但我们的研究仍有不足之处：对软骨前体细胞的分离是在正常软骨中进行的，而在急性或慢性损伤的软骨中未对其中软骨前体细胞的生物学特性进一步研究。我们在炎性介质对软骨前体细胞的分化影响研究中，仅取了 IL-1β 在0.1、1.0 ng/mL两个浓度以及在3周时间点进行检测，未进行更多浓度和时间点的研究，并且对另一重要炎性介质TNF-β未做相关实验。下一步将对以上方面进行相应的深入研究。
