引用本文： 王玺, 王胜, 肖玉周. 脐血间充质干细胞诱导分化为类雪旺细胞修复大鼠坐骨神经损伤的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(2): 213-220. doi: 10.7507/1002-1892.20150046 复制
随着工业及交通运输业的发展，工伤及交通事故伤所致周围神经损伤成为创伤骨科常见疾病。当神经缺损长度超过2 cm或达到缺损神经直径4倍以上时，需行神经移植修复 [1]。自体神经移植仍是目前修复周围神经缺损的“金标准”[2]，但存在供体来源有限、残留供区感觉功能障碍和增加供区创伤的缺点[3]。组织工程神经的发展为长节段神经缺损修复带来了新希望。雪旺细胞（Schwann cells，SCs）具有促进和引导轴突再生功能，是组织工程神经构建常用种子细胞。但自体SCs为终末期细胞，存在体外培养困难等缺陷；同种异体SCs移植后又会引起强烈排斥反应。人脐血间充质干细胞（human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCBMSCs）是一种具有多向分化潜能的干细胞，本实验采用hUCBMSCs作为种子细胞构建组织工程神经，修复大鼠15 mm坐骨神经缺损，了解其对神经损伤修复的作用，为hUCBMSCs修复周围神经缺损提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
SPF级3月龄雄性SD大鼠45只，体重200～ 250 g，由蚌埠医学院动物中心提供。
脐带血来源：无菌条件下收集蚌埠医学院第一附属医院产科足月剖腹产或自然分娩新生儿脐带血，均征得产妇及家属同意。产妇体健，无传染性疾病及妊娠并发症，胎儿无先天性疾病。
人MSCs扩增试剂盒Mesencult® （Stem Cell公司，加拿大）；人淋巴细胞分离液（密度1.077 g/ mL，天津灏洋生物制品科技有限责任公司）；高分子量羟乙基淀粉（6%；Hespan公司，美国）；DMEM/F12培养基、FBS（HyClone公司，美国）；β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME；Amresco公司，美国）；Forskolin（上海碧云天生物技术有限公司）；维A酸（Vitamin A acid，RA；Sigma公司，美国）；重组人Heregulin（HRG）、重组人PDGF-BB、重组人bFGF、重组人NGF（Pepro Tech公司，美国）；兔抗人S100b即用型、小鼠抗人胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）即用型（福州迈新生物技术有限公司）；兔抗人S100b、兔抗人P75（北京博奥森生物技术有限公司）；小鼠抗人GFAP（上海碧云天生物技术有限公司）；水合氯醛（上海国药集团化学试剂有限公司）。显微手术器械及显微缝合线（宁波市成和显微器械厂）；CO2培养箱（Thermo Scientific公司，美国）；CKX41倒置显微镜（Olympus公司，日本）；BL-410生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；IPP6.0图像分析系统（Media Cybernetics公司，美国）。
人MSCs扩增试剂盒Mesencult®、β-ME、Forskolin、RA、重组人PDGF-BB、重组人bFGF、重组人NGF、重组人HRG均参照文献[4]进行配制。
1.2 hUCBMSCs分离培养及鉴定
无菌条件下，取脐带血50～80 mL，人淋巴细胞分离液复合高分子量羟乙基淀粉分离hUCBMSCs，以（1.0～5.0）×107个/mL接种于含Mesencult®完全培养基（基础培养基450 mL、MSCs生长添加剂50 mL）的T-25塑料培养瓶中，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，隔天添加少许完全培养基，5～7 d首次换液，以后每3天换液1次，光镜下观察细胞形态变化。取第3代细胞重悬后流式细胞仪检测鉴定。
1.3 hUCBMSCs定向诱导分化为类SCs及鉴定
取第3代hUCBMSCs，按照文献[4]改良化学诱导联合细胞因子方法诱导培养。首先用含0.25 mmol/L β-ME+10 ng/mL bFGF的DMEM/F12培养液诱导24 h，后更换为含10%FBS的完全培养基培养24 h，后更换为含35 ng/mL RA的DMEM/F12培养液培养24 h，后更换为含10%FBS的完全培养基培养24 h，最后换用含5 ng/mL PDGF-BB、10 ng/ mL bFGF、100 ng/mL NGF、200 ng/mL HRG及5 μmol/ L Forskolin的DMEM/F12培养液培养4 d，倒置显微镜下观察细胞形态变化。诱导结束后，取细胞爬片，分别添加目的蛋白一抗（抗S100b、GFAP、P75；1∶200），免疫细胞化学染色检测神经胶质细胞标志物S100b、GFAP、P75表达。阳性细胞染色为棕色，镜下取10个非重叠视野计数（×100），计算细胞阳性 率。
1.4 组织工程神经构建
按照文献[5]方法，采用液氮反复冻融振荡洗涤法制备去细胞神经基膜管。取15只SD大鼠，锐性切取双侧坐骨神经约2.0 cm，置于含无菌超纯水的50 mL塑料离心管内，快速浸入-196℃液氮20 min，然后于37℃恒温水浴震荡箱内反复震荡1 h；反复液氮冻融及水浴震荡5次，制备去细胞神经基膜管，修剪至1.5 cm。取部分去细胞神经基膜管行HE染色及Laminin免疫组织化学染色观察。
将诱导成功的类SCs调整为密度1×107个/mL的细胞悬液，玻璃筒不锈钢针头微量注射器吸取100 μL细胞悬液，多点注入去细胞神经基膜管支架内，支架隆起后，将支架置入含10%FBS的DMEM/F12培养基内，37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱内培养7 d，构建组织工程神经。光镜下观察种子细胞分布情况。
1.5 周围神经缺损修复动物实验
另取30只SD大鼠，10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，游离坐骨神经，锐性切取同侧长约20 mm坐骨神经，待余下坐骨神经自然回缩后，形成长约15 mm坐骨神经缺损动物模型。根据修复方法不同，实验分为A、B、C 3组（n=10）：A组神经缺损采用9-0缝合线将预先构建好的组织工程神经与坐骨神经断端外膜牢固缝合；B组采用未复合类SCs的去细胞神经基膜管缝合；C组采用自体坐骨神经原位缝合。
1.5.1 大体观察
术后观察并记录各组大鼠步态、切口愈合、患肢是否出现溃疡及自噬等情况，并于坐骨神经功能指数（sciatic function index，SFI）测定后取材观察修复神经质地、形态、光泽以及与周围组织粘连情况。
1.5.2 SFI测定
参照沈江宁等[5]方法自制大鼠足印行走箱，根据Bain公式 [6]计算各组大鼠术后SFI。 SFI=0 为正常，-100 为神经完全损伤。所得数据绘制 SFI 曲线，并行统计学分析。
1.5.3 坐骨神经电生理检测
术后8周，3组各取10只大鼠以水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，采用BL-410生物机能实验系统，设置为刺激单脉冲，波宽0.05 ms，刺激强度Ⅳ，增益200倍，交流滤波50 Hz，行坐骨神经电生理检测，记录复合动作电位波幅及传导速度。
1.5.4 腓肠肌湿重及恢复率检测
术后8周，3组各取10只大鼠，电生理检测完成后，分别切取大鼠实验侧与健侧整块腓肠肌，电子天平称重，按以下公式计算大鼠腓肠肌湿重恢复率：（实验侧腓肠肌湿重 /健侧腓肠肌湿重）×100%。
1.5.5 再生神经纤维组织学观察
术后8周，3组各取10只大鼠，取修复神经中段，置于 10%中性甲醛固定，常规石蜡切片，行Masson染色，光镜下观察。每张切片取5个视野，采用IPP6.0图像分析系统测定再生神经中段有髓神经纤维密度、直径及髓鞘厚度和轴突直径，对再生神经行形态学分析。
1.6 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 hUCBMSCs形态学观察及表面标志鉴定
培养后2周，椭圆形细胞大量增殖，细胞形态向长梭形转变。随着培养时间延长，细胞生长至80%～90%融合，细胞胞体呈长梭形，排列较均一，形态类似成纤维样细胞，与BMSCs相似，但体积较小。原代细胞仍混杂部分破骨样细胞，第3代细胞几乎无混杂细胞，为形态均一的成纤维样细胞（图 1）。流式细胞仪检测结果示，hUCBMSCs高表达干细胞表面抗原CD73及黏附分子CD44，低表达或不表达造血干/祖细胞表面标志CD34，与BMSCs表面抗原标记一致（图 2）。
图1
hUCBMSCs形态学观察（×40） ⓐ 原代培养3 d ⓑ 原代培养5 d ⓒ 原代培养21 d ⓓ 第3代细胞 图 2 hUCBMSCs表面标志物鉴定 ⓐ 低表达CD34及高表达CD44 ⓑ 低表达CD34及高表达CD73 图 3 诱导后细胞形态学观察（×100） ⓐ β-ME+bFGF诱导后（诱导后1 d） ⓑ RA诱导后 （诱导后3 d） ⓒ 诱导结束后（诱导后7 d） 图 4 hUCBMSCs诱导结束后免疫细胞化学染色检测神经胶质细胞标志物表达(×200) ⓐ S100b ⓑ GFAP ⓒ P75
Figure1.
Morphological observation of hUCBMSCs (×40) ⓐ Primary cells cultured for 3 days ⓑ Primary cells cultured for 5 days ⓒ Primary cells cultured for 21 days ⓓ Cells in the 3rd generation Fig. 2 Surface markers identification of hUCBMSCs ⓐ Low expression of CD34 and high expression of CD44 ⓑ Low expression of CD34 and high expression of CD73 Fig. 3 Morphological observation of the induced hUCBMSCs (×100) ⓐ After inducted by β-mercaptoethanol+basic fibroblast growth factor (at 1 day after induction) ⓑ After inducted by Vitamin A acid (at 3 days after induction) ⓒ The end of induction (at 7 days after induction) Fig. 4 Expression of glia cell specific markers after induction by immunohistochemistry staining (×200) ⓐ S100b ⓑ Glial fibrillary acidic protein ⓒ P75
2.2 hUCBMSCs定向诱导分化为类SCs及鉴定
诱导结束后细胞呈细长梭形、三角形或出现突起，形态与SCs类似（图 3）。诱导结束后细胞免疫细胞化学染色示神经胶质细胞标志物S100b、GFAP及P75表达呈阳性（图 4）。S100b、GFAP及P75的细胞阳性率分别为 97.00%±1.63%、94.33%±2.05%和91.67%±1.70%。
2.3 组织工程神经构建
去细胞神经基膜管大体观察呈乳白色，半透明状，较正常神经质韧，且横纹消失。HE染色可见神经支架残留基底膜呈波浪状纵形排列，形成管柱状间隙。Laminin免疫组织化学染色观察可见神经支架残留基底膜之间较为空虚，呈棕灰色、管状，细胞结构基本消失。去细胞神经基膜管与种子细胞共培养7 d，可见种子细胞在支架内均匀分布。见图 5。
图5
组织工程神经构建 去细胞神经基膜管大体观察 ⓐ 去细胞神经基膜管HE染色(×100) ⓑ 去细胞神经基膜管Laminin免疫组织化学染色(×100） ⓒ 去细胞神经基膜管与细胞共培养7 d，细胞分布较均匀(×100) 图 6 术后8周大体观察 从左至右依次示大鼠患肢不能站立、红肿、溃疡及自噬现象 图 7 术后8周大鼠足趾张开程度 ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 图 8 术后8周各组大鼠修复神经大体观察 ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 图 10 术后8周各组大鼠再生神经纤维Masson染色 (×100) ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组
Figure5.
Reconstruction of tissue engineered nerve ⓐ The appearance of the acellular nerve basal membrane conduit HE staining of the acellular nerve basal membrane conduit (×100) ⓑ Laminin immunohistochemical staining of the acellular nerve basal membrane conduit (×100) ⓒ The cells co-cultured with acellular nerve basal membrane conduit for 7 days,showing well-distributed cells (×100) Fig. 6 General observation at 8 weeks after operation Astasia,red swelling,ulcer,and autophagy were shown from left to right Fig. 7 Opening degrees of the toe at 8 weeks after operation ⓐ Group A ⓑ Group B ⓒ Group C Fig. 8 General observation of the nerve in 3 groups at 8 weeks after operation ⓐ Group A ⓑ Group B ⓒ Group C Fig. 10 Masson staining observation of nerve fibers at 8 weeks after operation (×100) ⓐ Group A ⓑ Group B ⓒ Group C
2.4 动物实验相关检测
2.4.1 大体观察
实验动物术后均存活，无感染及死亡发生。各组大鼠术后患肢均出现失神经表现，如患肢瘫痪、不能站立、拖行、各趾并拢不能张开。术后l～2周，大鼠患肢负重区出现不能支撑、不同程度红肿、自噬及溃疡（图 6），其中A组3只、B组5 只、C组2只。A、C组大鼠患肢足部溃疡术后3 周开始愈合，4～5周基本痊愈；B组大鼠术后4 周溃疡开始愈合，5～6周基本痊愈。各组大鼠患肢踝关节均出现不同程度关节僵硬以及坐骨神经支配区肌肉萎缩。术后8周，各组大鼠患肢拖行及足趾张开程度均改善，A、C组较B组改善明显。见图 7。
术后8周，大体观察示A组组织工程神经管管壁无坏死及液化现象，周围轻度粘连，质地较软，基膜管周围布满血管网，神经吻合处连续性较好，但轻度膨大；B组去细胞神经基膜管在外观上与A组相似；C组自体神经周围粘连较A、B组轻，吻合口光滑，无明显膨大，颜色与正常神经相似。见图 8。
2.4.2 SFI
检测 各组大鼠术后1周因手术切口未愈合，且步态不稳，足迹不清，无法准确测量SFI；术后2周，切口已基本愈合，步态稍好转，故分别于术后2、4、6、8周计算各组大鼠术后SFI，并绘制SFI曲线（图 9）。各组大鼠术后SFI随时间延长呈逐渐降低趋势，其中C组SFI 恢复优于A、B组，A组优于B组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。
图9
各组术后SFI曲线
Figure9.
SFI curve at each time point after operation in 3 groups
表1
各组大鼠术后各时间点SFI检测（n=10，x±s）
Table1.
Changes of SFI in each group after operation（n=10，x±s）
2.4.3 坐骨神经电生理检测
术后8周，刺激坐骨神经近端吻合口，各组大鼠远端吻合口处均可检测到神经复合动作电位，波幅及传导速度C组均优于A、B组，A组优于B组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。
表2
术后8周各组大鼠坐骨神经电生理检测（n=10，x±s）
Table2.
Detection of electrophysiology in each group at 8 weeks after operation（n=10，x±s）
2.4.4 腓肠肌湿重及恢复率检测
术后8周各组大鼠实验侧小腿腓肠肌与健侧相比均发生不同程度萎缩。实验侧腓肠肌湿重及湿重恢复率C组优于A、B组，A组优于B组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 3。
表3
术后8周各组大鼠腓肠肌湿重及恢复率比较（n=10，x±s）
Table3.
Wet weight and recovery rate of gastrocnemius in 3 groups at 8 weeks after operation（n=10，x±s）
2.4.5 再生神经纤维组织学观察
Masson染色后髓鞘被染成淡红色轮状，中间深染点状为轴突，神经外膜及周围结缔组织被染成蓝绿色。A组可见大量再生神经纤维，有髓神经纤维排列较为整齐、致密，纤维直径相似。A组再生神经纤维数量明显多于B组，但髓鞘厚度以及排列规律性不及C组，见图 10。C组有髓神经纤维密度、直径及髓鞘厚度和轴突直径均明显多于A、B组，A组多于B组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 4。
表4
术后8周各组神经有髓神经纤维密度、直径及髓鞘厚度、轴突直径检测（n=10，x±s）
Table4.
The density and diameter of medullated fibers,thickness of myelinated axon,and axon diameter of each group（n=10，x±s）
3 讨论
3.1 组织工程神经种子细胞
周围神经缺损修复已成为国内外学者亟待解决的难题之一，组织工程的发展为周围神经缺损修复带来了新希望。SCs作为神经损伤修复的主要功能细胞，在组织工程神经构建中处于核心地位。然而，自体SCs为终末期细胞，存在增殖及活性差、体外分离培养困难，来源缺乏需额外增加损伤等缺点，限制了其临床广泛使用[7]。而同种异体SCs移植后会被受体机体强烈排斥，在体内难以存活[8]。因此，寻找一种合适的种子细胞来源成为组织工程神经的主要研究方向。hUCBMSCs具有自我更新和多向分化潜能[9]，与其他来源MSCs相比，具有来源丰富、易于采集和运输、移植后无明显排斥反应、无伦理问题等诸多优点[10]，且不存在BMSCs含量和多向分化潜能随骨髓捐赠者年龄增加而递减的缺陷[11]。
本实验中，我们采用hUCBMSCs作为种子细胞，应用改良化学诱导法并联合细胞因子，成功诱导为类SCs，经过免疫细胞化学染色检测，其表达胶质细胞表面标记物S100b、GFAP、P75，具有一定的SCs生理学功能。
3.2 神经支架材料
支架材料是组织工程神经的重要组成部分。同种异体神经仍是支架材料的主要来源，但细胞介导的免疫排斥反应是同种异体神经移植面临的主要问题[12]，多数学者认为活性SCs是同种异体神经移植的主要抗原成分[13]，而同种异体神经中胶原及基底膜所引起的排斥反应小[14]，且脱细胞神经基质不会产生全身及局部排斥反应，也无过敏、深部感染或肝肾毒性等副作用[15-16]。脱细胞处理后的神经支架具备促进神经再生的天然三维结构及细胞外基质[17]，具有良好的应用前景。因此，我们选择脱细胞神经作为支架材料。支架制备的关键在于如何去除细胞成分并保持神经基膜管的完整性[18]。考虑到化学萃取法可能残留部分化学试剂，对种子细胞及机体存在毒副作用，我们采用宁仁德等[19]的液氮反复冻融振荡洗涤法制备去细胞神经基膜管作为神经支架。经HE染色和Laminin染色显示，该支架基膜完整、管道通畅，基本无残留细胞结构，且无化学试剂残留，符合组织工程神经支架材料要求。
3.3 实验结果分析
动物实验中，hUCBMSCs来源的类SCs接种至去细胞神经基膜管后表现出较好的神经损伤修复效果。相对于单纯去细胞神经基膜管组，接种了hUCBMSCs的去细胞神经基膜管的神经纤维密度及直径、髓鞘厚度和轴突直径均有所增加，提示其能够在细胞水平促进神经损伤修复；同时神经移植物传导速度及动作电位波幅增大，说明其能改善神经电生理功能；小腿腓肠肌湿重及湿重恢复率均有所提高，一定程度反映神经损伤后hUCBMSCs能够促进支配肌肉功能改善。
综上述，hUCBMSCs来源的类SCs对周围神经损伤修复作用明确，采用hUCBMSCs构建组织工程神经可行。
随着工业及交通运输业的发展，工伤及交通事故伤所致周围神经损伤成为创伤骨科常见疾病。当神经缺损长度超过2 cm或达到缺损神经直径4倍以上时，需行神经移植修复 [1]。自体神经移植仍是目前修复周围神经缺损的“金标准”[2]，但存在供体来源有限、残留供区感觉功能障碍和增加供区创伤的缺点[3]。组织工程神经的发展为长节段神经缺损修复带来了新希望。雪旺细胞（Schwann cells，SCs）具有促进和引导轴突再生功能，是组织工程神经构建常用种子细胞。但自体SCs为终末期细胞，存在体外培养困难等缺陷；同种异体SCs移植后又会引起强烈排斥反应。人脐血间充质干细胞（human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCBMSCs）是一种具有多向分化潜能的干细胞，本实验采用hUCBMSCs作为种子细胞构建组织工程神经，修复大鼠15 mm坐骨神经缺损，了解其对神经损伤修复的作用，为hUCBMSCs修复周围神经缺损提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
SPF级3月龄雄性SD大鼠45只，体重200～ 250 g，由蚌埠医学院动物中心提供。
脐带血来源：无菌条件下收集蚌埠医学院第一附属医院产科足月剖腹产或自然分娩新生儿脐带血，均征得产妇及家属同意。产妇体健，无传染性疾病及妊娠并发症，胎儿无先天性疾病。
人MSCs扩增试剂盒Mesencult® （Stem Cell公司，加拿大）；人淋巴细胞分离液（密度1.077 g/ mL，天津灏洋生物制品科技有限责任公司）；高分子量羟乙基淀粉（6%；Hespan公司，美国）；DMEM/F12培养基、FBS（HyClone公司，美国）；β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME；Amresco公司，美国）；Forskolin（上海碧云天生物技术有限公司）；维A酸（Vitamin A acid，RA；Sigma公司，美国）；重组人Heregulin（HRG）、重组人PDGF-BB、重组人bFGF、重组人NGF（Pepro Tech公司，美国）；兔抗人S100b即用型、小鼠抗人胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）即用型（福州迈新生物技术有限公司）；兔抗人S100b、兔抗人P75（北京博奥森生物技术有限公司）；小鼠抗人GFAP（上海碧云天生物技术有限公司）；水合氯醛（上海国药集团化学试剂有限公司）。显微手术器械及显微缝合线（宁波市成和显微器械厂）；CO2培养箱（Thermo Scientific公司，美国）；CKX41倒置显微镜（Olympus公司，日本）；BL-410生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；IPP6.0图像分析系统（Media Cybernetics公司，美国）。
人MSCs扩增试剂盒Mesencult®、β-ME、Forskolin、RA、重组人PDGF-BB、重组人bFGF、重组人NGF、重组人HRG均参照文献[4]进行配制。
1.2 hUCBMSCs分离培养及鉴定
无菌条件下，取脐带血50～80 mL，人淋巴细胞分离液复合高分子量羟乙基淀粉分离hUCBMSCs，以（1.0～5.0）×107个/mL接种于含Mesencult®完全培养基（基础培养基450 mL、MSCs生长添加剂50 mL）的T-25塑料培养瓶中，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，隔天添加少许完全培养基，5～7 d首次换液，以后每3天换液1次，光镜下观察细胞形态变化。取第3代细胞重悬后流式细胞仪检测鉴定。
1.3 hUCBMSCs定向诱导分化为类SCs及鉴定
取第3代hUCBMSCs，按照文献[4]改良化学诱导联合细胞因子方法诱导培养。首先用含0.25 mmol/L β-ME+10 ng/mL bFGF的DMEM/F12培养液诱导24 h，后更换为含10%FBS的完全培养基培养24 h，后更换为含35 ng/mL RA的DMEM/F12培养液培养24 h，后更换为含10%FBS的完全培养基培养24 h，最后换用含5 ng/mL PDGF-BB、10 ng/ mL bFGF、100 ng/mL NGF、200 ng/mL HRG及5 μmol/ L Forskolin的DMEM/F12培养液培养4 d，倒置显微镜下观察细胞形态变化。诱导结束后，取细胞爬片，分别添加目的蛋白一抗（抗S100b、GFAP、P75；1∶200），免疫细胞化学染色检测神经胶质细胞标志物S100b、GFAP、P75表达。阳性细胞染色为棕色，镜下取10个非重叠视野计数（×100），计算细胞阳性 率。
1.4 组织工程神经构建
按照文献[5]方法，采用液氮反复冻融振荡洗涤法制备去细胞神经基膜管。取15只SD大鼠，锐性切取双侧坐骨神经约2.0 cm，置于含无菌超纯水的50 mL塑料离心管内，快速浸入-196℃液氮20 min，然后于37℃恒温水浴震荡箱内反复震荡1 h；反复液氮冻融及水浴震荡5次，制备去细胞神经基膜管，修剪至1.5 cm。取部分去细胞神经基膜管行HE染色及Laminin免疫组织化学染色观察。
将诱导成功的类SCs调整为密度1×107个/mL的细胞悬液，玻璃筒不锈钢针头微量注射器吸取100 μL细胞悬液，多点注入去细胞神经基膜管支架内，支架隆起后，将支架置入含10%FBS的DMEM/F12培养基内，37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱内培养7 d，构建组织工程神经。光镜下观察种子细胞分布情况。
1.5 周围神经缺损修复动物实验
另取30只SD大鼠，10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，游离坐骨神经，锐性切取同侧长约20 mm坐骨神经，待余下坐骨神经自然回缩后，形成长约15 mm坐骨神经缺损动物模型。根据修复方法不同，实验分为A、B、C 3组（n=10）：A组神经缺损采用9-0缝合线将预先构建好的组织工程神经与坐骨神经断端外膜牢固缝合；B组采用未复合类SCs的去细胞神经基膜管缝合；C组采用自体坐骨神经原位缝合。
1.5.1 大体观察
术后观察并记录各组大鼠步态、切口愈合、患肢是否出现溃疡及自噬等情况，并于坐骨神经功能指数（sciatic function index，SFI）测定后取材观察修复神经质地、形态、光泽以及与周围组织粘连情况。
1.5.2 SFI测定
参照沈江宁等[5]方法自制大鼠足印行走箱，根据Bain公式 [6]计算各组大鼠术后SFI。 SFI=0 为正常，-100 为神经完全损伤。所得数据绘制 SFI 曲线，并行统计学分析。
1.5.3 坐骨神经电生理检测
术后8周，3组各取10只大鼠以水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，采用BL-410生物机能实验系统，设置为刺激单脉冲，波宽0.05 ms，刺激强度Ⅳ，增益200倍，交流滤波50 Hz，行坐骨神经电生理检测，记录复合动作电位波幅及传导速度。
1.5.4 腓肠肌湿重及恢复率检测
术后8周，3组各取10只大鼠，电生理检测完成后，分别切取大鼠实验侧与健侧整块腓肠肌，电子天平称重，按以下公式计算大鼠腓肠肌湿重恢复率：（实验侧腓肠肌湿重 /健侧腓肠肌湿重）×100%。
1.5.5 再生神经纤维组织学观察
术后8周，3组各取10只大鼠，取修复神经中段，置于 10%中性甲醛固定，常规石蜡切片，行Masson染色，光镜下观察。每张切片取5个视野，采用IPP6.0图像分析系统测定再生神经中段有髓神经纤维密度、直径及髓鞘厚度和轴突直径，对再生神经行形态学分析。
1.6 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 hUCBMSCs形态学观察及表面标志鉴定
培养后2周，椭圆形细胞大量增殖，细胞形态向长梭形转变。随着培养时间延长，细胞生长至80%～90%融合，细胞胞体呈长梭形，排列较均一，形态类似成纤维样细胞，与BMSCs相似，但体积较小。原代细胞仍混杂部分破骨样细胞，第3代细胞几乎无混杂细胞，为形态均一的成纤维样细胞（图 1）。流式细胞仪检测结果示，hUCBMSCs高表达干细胞表面抗原CD73及黏附分子CD44，低表达或不表达造血干/祖细胞表面标志CD34，与BMSCs表面抗原标记一致（图 2）。
图1
hUCBMSCs形态学观察（×40） ⓐ 原代培养3 d ⓑ 原代培养5 d ⓒ 原代培养21 d ⓓ 第3代细胞 图 2 hUCBMSCs表面标志物鉴定 ⓐ 低表达CD34及高表达CD44 ⓑ 低表达CD34及高表达CD73 图 3 诱导后细胞形态学观察（×100） ⓐ β-ME+bFGF诱导后（诱导后1 d） ⓑ RA诱导后 （诱导后3 d） ⓒ 诱导结束后（诱导后7 d） 图 4 hUCBMSCs诱导结束后免疫细胞化学染色检测神经胶质细胞标志物表达(×200) ⓐ S100b ⓑ GFAP ⓒ P75
Figure1.
Morphological observation of hUCBMSCs (×40) ⓐ Primary cells cultured for 3 days ⓑ Primary cells cultured for 5 days ⓒ Primary cells cultured for 21 days ⓓ Cells in the 3rd generation Fig. 2 Surface markers identification of hUCBMSCs ⓐ Low expression of CD34 and high expression of CD44 ⓑ Low expression of CD34 and high expression of CD73 Fig. 3 Morphological observation of the induced hUCBMSCs (×100) ⓐ After inducted by β-mercaptoethanol+basic fibroblast growth factor (at 1 day after induction) ⓑ After inducted by Vitamin A acid (at 3 days after induction) ⓒ The end of induction (at 7 days after induction) Fig. 4 Expression of glia cell specific markers after induction by immunohistochemistry staining (×200) ⓐ S100b ⓑ Glial fibrillary acidic protein ⓒ P75
2.2 hUCBMSCs定向诱导分化为类SCs及鉴定
诱导结束后细胞呈细长梭形、三角形或出现突起，形态与SCs类似（图 3）。诱导结束后细胞免疫细胞化学染色示神经胶质细胞标志物S100b、GFAP及P75表达呈阳性（图 4）。S100b、GFAP及P75的细胞阳性率分别为 97.00%±1.63%、94.33%±2.05%和91.67%±1.70%。
2.3 组织工程神经构建
去细胞神经基膜管大体观察呈乳白色，半透明状，较正常神经质韧，且横纹消失。HE染色可见神经支架残留基底膜呈波浪状纵形排列，形成管柱状间隙。Laminin免疫组织化学染色观察可见神经支架残留基底膜之间较为空虚，呈棕灰色、管状，细胞结构基本消失。去细胞神经基膜管与种子细胞共培养7 d，可见种子细胞在支架内均匀分布。见图 5。
图5
组织工程神经构建 去细胞神经基膜管大体观察 ⓐ 去细胞神经基膜管HE染色(×100) ⓑ 去细胞神经基膜管Laminin免疫组织化学染色(×100） ⓒ 去细胞神经基膜管与细胞共培养7 d，细胞分布较均匀(×100) 图 6 术后8周大体观察 从左至右依次示大鼠患肢不能站立、红肿、溃疡及自噬现象 图 7 术后8周大鼠足趾张开程度 ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 图 8 术后8周各组大鼠修复神经大体观察 ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 图 10 术后8周各组大鼠再生神经纤维Masson染色 (×100) ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组
Figure5.
Reconstruction of tissue engineered nerve ⓐ The appearance of the acellular nerve basal membrane conduit HE staining of the acellular nerve basal membrane conduit (×100) ⓑ Laminin immunohistochemical staining of the acellular nerve basal membrane conduit (×100) ⓒ The cells co-cultured with acellular nerve basal membrane conduit for 7 days,showing well-distributed cells (×100) Fig. 6 General observation at 8 weeks after operation Astasia,red swelling,ulcer,and autophagy were shown from left to right Fig. 7 Opening degrees of the toe at 8 weeks after operation ⓐ Group A ⓑ Group B ⓒ Group C Fig. 8 General observation of the nerve in 3 groups at 8 weeks after operation ⓐ Group A ⓑ Group B ⓒ Group C Fig. 10 Masson staining observation of nerve fibers at 8 weeks after operation (×100) ⓐ Group A ⓑ Group B ⓒ Group C
2.4 动物实验相关检测
2.4.1 大体观察
实验动物术后均存活，无感染及死亡发生。各组大鼠术后患肢均出现失神经表现，如患肢瘫痪、不能站立、拖行、各趾并拢不能张开。术后l～2周，大鼠患肢负重区出现不能支撑、不同程度红肿、自噬及溃疡（图 6），其中A组3只、B组5 只、C组2只。A、C组大鼠患肢足部溃疡术后3 周开始愈合，4～5周基本痊愈；B组大鼠术后4 周溃疡开始愈合，5～6周基本痊愈。各组大鼠患肢踝关节均出现不同程度关节僵硬以及坐骨神经支配区肌肉萎缩。术后8周，各组大鼠患肢拖行及足趾张开程度均改善，A、C组较B组改善明显。见图 7。
术后8周，大体观察示A组组织工程神经管管壁无坏死及液化现象，周围轻度粘连，质地较软，基膜管周围布满血管网，神经吻合处连续性较好，但轻度膨大；B组去细胞神经基膜管在外观上与A组相似；C组自体神经周围粘连较A、B组轻，吻合口光滑，无明显膨大，颜色与正常神经相似。见图 8。
2.4.2 SFI
检测 各组大鼠术后1周因手术切口未愈合，且步态不稳，足迹不清，无法准确测量SFI；术后2周，切口已基本愈合，步态稍好转，故分别于术后2、4、6、8周计算各组大鼠术后SFI，并绘制SFI曲线（图 9）。各组大鼠术后SFI随时间延长呈逐渐降低趋势，其中C组SFI 恢复优于A、B组，A组优于B组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。
图9
各组术后SFI曲线
Figure9.
SFI curve at each time point after operation in 3 groups
表1
各组大鼠术后各时间点SFI检测（n=10，x±s）
Table1.
Changes of SFI in each group after operation（n=10，x±s）
2.4.3 坐骨神经电生理检测
术后8周，刺激坐骨神经近端吻合口，各组大鼠远端吻合口处均可检测到神经复合动作电位，波幅及传导速度C组均优于A、B组，A组优于B组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。
表2
术后8周各组大鼠坐骨神经电生理检测（n=10，x±s）
Table2.
Detection of electrophysiology in each group at 8 weeks after operation（n=10，x±s）
2.4.4 腓肠肌湿重及恢复率检测
术后8周各组大鼠实验侧小腿腓肠肌与健侧相比均发生不同程度萎缩。实验侧腓肠肌湿重及湿重恢复率C组优于A、B组，A组优于B组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 3。
表3
术后8周各组大鼠腓肠肌湿重及恢复率比较（n=10，x±s）
Table3.
Wet weight and recovery rate of gastrocnemius in 3 groups at 8 weeks after operation（n=10，x±s）
2.4.5 再生神经纤维组织学观察
Masson染色后髓鞘被染成淡红色轮状，中间深染点状为轴突，神经外膜及周围结缔组织被染成蓝绿色。A组可见大量再生神经纤维，有髓神经纤维排列较为整齐、致密，纤维直径相似。A组再生神经纤维数量明显多于B组，但髓鞘厚度以及排列规律性不及C组，见图 10。C组有髓神经纤维密度、直径及髓鞘厚度和轴突直径均明显多于A、B组，A组多于B组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 4。
表4
术后8周各组神经有髓神经纤维密度、直径及髓鞘厚度、轴突直径检测（n=10，x±s）
Table4.
The density and diameter of medullated fibers,thickness of myelinated axon,and axon diameter of each group（n=10，x±s）
3 讨论
3.1 组织工程神经种子细胞
周围神经缺损修复已成为国内外学者亟待解决的难题之一，组织工程的发展为周围神经缺损修复带来了新希望。SCs作为神经损伤修复的主要功能细胞，在组织工程神经构建中处于核心地位。然而，自体SCs为终末期细胞，存在增殖及活性差、体外分离培养困难，来源缺乏需额外增加损伤等缺点，限制了其临床广泛使用[7]。而同种异体SCs移植后会被受体机体强烈排斥，在体内难以存活[8]。因此，寻找一种合适的种子细胞来源成为组织工程神经的主要研究方向。hUCBMSCs具有自我更新和多向分化潜能[9]，与其他来源MSCs相比，具有来源丰富、易于采集和运输、移植后无明显排斥反应、无伦理问题等诸多优点[10]，且不存在BMSCs含量和多向分化潜能随骨髓捐赠者年龄增加而递减的缺陷[11]。
本实验中，我们采用hUCBMSCs作为种子细胞，应用改良化学诱导法并联合细胞因子，成功诱导为类SCs，经过免疫细胞化学染色检测，其表达胶质细胞表面标记物S100b、GFAP、P75，具有一定的SCs生理学功能。
3.2 神经支架材料
支架材料是组织工程神经的重要组成部分。同种异体神经仍是支架材料的主要来源，但细胞介导的免疫排斥反应是同种异体神经移植面临的主要问题[12]，多数学者认为活性SCs是同种异体神经移植的主要抗原成分[13]，而同种异体神经中胶原及基底膜所引起的排斥反应小[14]，且脱细胞神经基质不会产生全身及局部排斥反应，也无过敏、深部感染或肝肾毒性等副作用[15-16]。脱细胞处理后的神经支架具备促进神经再生的天然三维结构及细胞外基质[17]，具有良好的应用前景。因此，我们选择脱细胞神经作为支架材料。支架制备的关键在于如何去除细胞成分并保持神经基膜管的完整性[18]。考虑到化学萃取法可能残留部分化学试剂，对种子细胞及机体存在毒副作用，我们采用宁仁德等[19]的液氮反复冻融振荡洗涤法制备去细胞神经基膜管作为神经支架。经HE染色和Laminin染色显示，该支架基膜完整、管道通畅，基本无残留细胞结构，且无化学试剂残留，符合组织工程神经支架材料要求。
3.3 实验结果分析
动物实验中，hUCBMSCs来源的类SCs接种至去细胞神经基膜管后表现出较好的神经损伤修复效果。相对于单纯去细胞神经基膜管组，接种了hUCBMSCs的去细胞神经基膜管的神经纤维密度及直径、髓鞘厚度和轴突直径均有所增加，提示其能够在细胞水平促进神经损伤修复；同时神经移植物传导速度及动作电位波幅增大，说明其能改善神经电生理功能；小腿腓肠肌湿重及湿重恢复率均有所提高，一定程度反映神经损伤后hUCBMSCs能够促进支配肌肉功能改善。
综上述，hUCBMSCs来源的类SCs对周围神经损伤修复作用明确，采用hUCBMSCs构建组织工程神经可行。
