引用本文： 周勇, 邹昌, 闵理, 石锐, 张闻力, 罗翼, 彭静, 段宏, 屠重棋, 张晖. 腺病毒介导Wnt10b基因调控人BMSCs成骨成脂分化的体外实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(10): 1284-1291. doi: 10.7507/1002-1892.20140278 复制
MSCs是成骨细胞和脂肪细胞共同的前体细胞[1]。体外研究发现，诱导MSCs成骨分化的因素会抑制其成脂分化[2]，这与病理学及流行病学发现的老龄化、骨丢失和骨质疏松伴随骨髓内脂肪组织增加一致[3-4]。目前体内外实验均支持“细胞系竞争”的学说，即骨内以牺牲成骨为代价的脂肪细胞增多，是导致骨质疏松症等骨丢失性疾病骨量减少的重要原因之一[5-7]。但是MSCs成骨-成脂反向分化的具体细胞学机制还不清楚。
随着对骨代谢机制研究的深入，Wnt信号通路所起关键作用引起广泛关注，特别是经典Wnt信号通路[8-11]。研究发现，Wnt10b基因在调控MSCs成骨成脂分化中起关键作用，Wnt10b有可能成为治疗骨丢失和/或肥胖相关疾病的新手段[12-14]。目前通过转基因鼠对Wnt10b的研究较为集中，最早Longo等[13]发现脂肪型脂肪酸结合蛋白4（adipocyte fatty acid binding protein 4，FABP4）启动子调控下的Wnt10b过表达转基因鼠（FABP4-Wnt10b鼠）出现骨量和骨强度的增加，并且阻止因年龄和激素导致的骨量丢失[15]；而敲除Wnt10b基因鼠（Wnt10b-/-鼠）因骨小梁数量减少和间隔增大，导致骨体积和骨密度降低了30%。敲除低密度脂蛋白受体相关蛋白5基因鼠（LRP5-/-鼠）也出现了类似表现，原因可能是内源性Wnt10b信号的减少[16-17]。骨钙素（osteocalcin，OST）启动子调控的Wnt10b基因过表达鼠（OST-Wnt10b鼠）骨量增加约75%，并且与野生鼠相比成骨细胞数量明显增加，但破骨细胞无明显改变[18]。杂合子Wnt10b鼠（Wnt10b+/-鼠）6个月时出现骨小梁明显减少，成骨细胞功能减退和数量减少，但破骨细胞未受到明显影响。更重要的是Wnt10b还具有维持MSCs自我更新及MSCs数量的能力，Wnt10b可以决定MSCs的命运[19]，进一步说明Wnt10b在调控MSCs成骨成脂分化中起关键作用。但体外细胞实验研究相对较少，目前尚未见采用人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）进行的相关实验研究。本研究旨在进一步探索Wnt10b基因调控hBMSCs成骨成脂分化的分子机制以及Wnt10b基因是否对hBMSCs也具有类似作用，为探索Wnt10b调控hBMSCs成骨成脂分化提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 Wnt10b基因表达腺病毒载体构建与转染效率检测
1.1.1 Wnt10b基因表达腺病毒载体的构建
采用PCR扩增Wnt10b基因CDS区，并在上游引入BamHⅠ酶切点，下游引入EcoRⅠ酶切点。引物序列：Wnt10b上游5'-CGGGATCCGCCACCATGCTGGAGG-AGCCCCGG-3'，下游5'-GGAATTCTCACTTACACAC-ATTCACCCACTCT-3'。产物纯化后双酶切基因片段，再将酶切后的Wnt10b基因片段和pYr-adshuttle-1载体带进行连接，连接产物予以转化大肠杆菌感受态细胞进行重组质粒的扩增和提取。
1.1.2 Wnt10b基因沉默（Wnt10b-shRNA）腺病毒载体的构建
根据shRNA靶点的选择原则，从TRC shRNA数据库中择优选取3条Wnt10b-shRNA序列作为待筛靶序列，设计并合成Wnt10b-shRNA引物：Wnt10b-shRNA-83上游5'-CACCCGGGCTCTAAGCAATGAG-ATTCTCGAGAATCTCATTGCTTAGAGCCCGTTT-TTTG-3'，下游5'-AGCTCAAAAAACGGGCTCTAAG-CAATGAGATTCTCGAGAATCTCATTGCTTAGAG-CCCG-3'；Wnt10b-shRNA-84上游5'-CACCCTTTGAG-AAGTCTCCTGACTTCTCGAGAAGTCAGGAGACT-TCTCAAAGTTTTTTG-3'，下游5'-AGCTCAAAAAAC-TTTGAGAAGTCTCCTGACTTCTCGAGAAGTCA-GGAGACTTCTCAAAG-3'；Wnt10b-shRNA-87上游5'-
CACCCGGTTTCCGAGAAAGTGCTTTCTCGA-GAAAGCACTTTCTCGGAAACCGTT-TTTTG-3'，下游5'-AGCTCAAAAAACGGTTTCCGAGAAAGTGCTTTCTCGAGAAAGCACTTTCTCGGAA-ACCG-3'。将合成引物分别与BsaⅠ（NEB）酶切后的pYr-1.1连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞进行重组质粒的扩增和提取。
1.1.3 所构建病毒载体转染效率检测
选取HEK293细胞作为转染对象，以未行任何处理的HEK293细胞为空白对照（NC组），以pYr-1.1-HK质粒（空质粒）转染的HEK293细胞为阴性对照组（HK组），以pYr-adshuttle-1-Wnt10b质粒转染的HEK293细胞为阳性对照组（Wnt10b组），以pYr-1.1-hWnt10b-shRNA-83、pYr-1.1-hWnt10b-shRNA-84、pYr-1.1-hWnt10b-shRNA-87 3个质粒转染的HEK293细胞为实验组（分别为83干扰组、84干扰组和87干扰组），分别予以相应处理后行RT-PCR检测，引物对：Wnt10b-F196：5'-CACTGTCCCGAGGCAAGAG-3'，Wnt10b-R196：5'-TTGTGGATTCGCATTCGTG-3'，GAPDH-F452：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，GAPDH-R452：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。
1.1.4 病毒包装
通过LR体外同源重组将穿梭载体pYr-adshuttle-1-Wnt10b和干扰效果最好的质粒表达框构建至pAd/PL-DEST腺病毒表达载体上，PacⅠ酶切重组腺病毒质粒并转染HEK293细胞，进行重组腺病毒的扩增，半数组织培养感染剂量法检测重组腺病毒感染性滴度。
1.2 hBMSCs分离培养
骨髓样本来源于四川大学华西医院骨科4例住院患者，研究通过医院伦理委员会批准，患者均知情同意。其中男3例，女1例；年龄20～40岁。均为因创伤需行取髂骨植骨手术者，术前检查证实无造血系统及肿瘤等疾患；全麻下手术，取髂骨时使用无菌注射器收集溢出的骨髓液，采用密度梯度离心法获取hBMSCs，置于完全培养基（含10%FBS的DMEM培养基）中，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱内培养并传代，取第4代细胞进行实验。
1.3 实验分组及检测指标
取第4代hBMSCs，以5 × 106个/mL浓度接种于含完全培养基的T-75培养瓶中，当生长达80%融合后，将培养瓶中一部分hBMSCs消化转移至含载玻片的6孔培养板，行ALP、茜素红染色和油红O染色；另一部分细胞行实时荧光定量PCR和Western blot检测。实验分为4组，A、B、C组分别加入Wnt10b基因表达腺病毒载体、Wnt10b-shRNA腺病毒载体和空病毒转染细胞，D组细胞不进行转染作为空白对照组。
1.3.1 成骨相关检测
①ALP和茜素红染色：取各组细胞，加入成骨诱导培养基（含10%FBS、0.1 μmol/L地塞米松、50 μmol/L抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠的DMEM培养基）培养，7 d后行ALP染色观察，14 d后行茜素红染色观察，并与各组未诱导细胞进行比较。
②实时荧光定量PCR检测：取成骨诱导后10 d各组细胞，采用实时荧光定量PCR检测成骨相关基因Runx2、OST、ALP及Ⅰ型胶原的相对表达量，并与未诱导细胞进行比较。RNA提取后，采用随机引物利用逆转录酶逆转录成cDNA，采用Revert AidTM Frist Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司，加拿大）进行扩增。引物由成都立康科技有限公司提供；反应体系：10 × buffer（Mg2+ free）3 µL、MgCl2（25 mmol/ L）3 µL、dNTP（25 mmol/L）0.36 µL、上游引物（10 µmol/ L）1 µL、下游引物（10 µmol/L）1 µL、Taq酶（5 U/µL）0.3 µL、ddH2O 15.34 µL、cDNA模板5 µL。扩增条件：94℃、2 min；94℃、20 s，56℃、30 s，60℃、40 s，30个循环；72℃延伸5 min。分析绘制扩增动力学曲线，根据动力学曲线确定每个样品管中荧光强度增加到某一特定阈值时的扩增循环数（Ct值），通过2-ΔΔCt公式计算相对表达量。
③Western blot检测：取成骨诱导后10 d各组细胞，采用Western blot法检测成骨相关蛋白ALP、OST表达，并与未诱导细胞进行比较。于冰上裂解提取细胞总蛋白，配置SDS-PAGE胶，将蛋白质转印至聚偏氟乙烯膜表面，用含10%脱脂奶粉的TBS缓冲液于37℃封闭60 min，加入一抗（1∶500），脱色摇床摇1 h；TBS缓冲液冲洗4次，加入二抗（1∶1 000），脱色摇床摇1 h；TBS缓冲液冲洗4次，用ECL试剂盒进行化学发光检测，ECL A、B液等体积混合滴于膜上，5 min后暗室压片、曝光、显影和定影，并行定量检测。
1.3.2 成脂相关检测
①油红O染色：取各组细胞，加入成脂诱导培养基（含10%FBS、1 μmol/L地塞米松、10 μmol/L胰岛素、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、200 μmol/L吲哚美辛的DMEM培养基）培养，14 d后行油红O染色，并与各组未诱导细胞进行比较。
②实时荧光定量PCR检测：取成脂诱导后10 d各组细胞，同1.3.1方法采用实时荧光定量PCR检测成脂相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）、CCAAT增强子结合蛋白α（CCAAT enhancer binding protein α，C/EBPα）、C/EBPβ、FABP4的相对表达量，并与未诱导细胞进行比较。
③Western blot检测：取成脂诱导后10 d各组细胞，同1.3.1方法采用Western blot法检测成脂相关蛋白PPARγ和FABP4表达，并与未诱导细胞进行比较。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 病毒载体转染效率检测
结果显示Wnt10b组Wnt10b基因显著表达，84干扰组和87干扰组Wnt10b基因的表达明显受到干扰，其中87干扰组即pYr-1.1-hWnt10b-shRNA-87干扰效果最好。见图 1。所构建病毒滴度为5 × 109 PFU/mL。
图1
RT-PCR检测病毒载体转染效率1：NC组2：HK组3：Wnt10b组4：83干扰组5：84干扰组6：87干扰组
Figure1.
Transfection efficiency of virus vector by RT-PCR detection 1: NC group 2: HK group 3: Wnt10b group 4: 83 interference group 5: 84 interference group 6: 87 interference group
2.2 成骨相关检测
2.2.1 ALP染色
成骨诱导培养7 d，4组ALP染色均为阳性，其中A组呈强阳性，B组染色最弱（图 2）；无诱导培养7 d，A组ALP染色呈弱阳性，其余3组均为阴性（图 3）。
图2
各组成骨诱导7 d ALP染色（× 200） ⓐA组 ⓑB组 ⓒC组 ⓓD组 图 3 各组无成骨诱导7 d ALP染色（× 200） ⓐA组 ⓑB组 ⓒC组 ⓓD组 图 4 各组成骨诱导14 d茜素红染色（× 200） ⓐA组 ⓑB组 ⓒC组 ⓓD组 图 5 各组无成骨诱导14 d茜素红染色（× 200） ⓐA组 ⓑB组 ⓒC组 ⓓD组
Figure2.
ALP staining observation at 7 days after osteogenic induced culture (× 200) ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C ⓓGroup D Fig.3 ALP staining observation at 7 days after non-induced culture (× 200) ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C ⓓGroup DFig.4 Alizarin red staining observation at 14 days after osteogenic induced culture (× 200) ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C ⓓGroup DFig.5 Alizarin red staining observation at 14 days after non-induced culture (× 200) ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C ⓓGroup D
2.2.2 茜素红染色
成骨诱导培养14 d，A组出现大量片状融合褐色矿化结节，B组见少许点状褐色矿化结节，C、D组出现大量点状褐色矿化结节（图 4）；无诱导培养14 d，A组可见大量点状褐色矿化结节，C、D组偶见不典型矿化结节，B组几乎未见矿化结节（图 5）。
2.2.3 实时荧光定量PCR检测
成骨诱导培养10 d，A组Runx2、OST、ALP及Ⅰ型胶原mRNA相对表达量均显著高于B、C、D组，差异有统计学意义（P＜0.05）；除Runx2外，B组OST、ALP及Ⅰ型胶原mRNA相对表达量均显著低于C、D组，差异有统计学意义（P＜0.05）；C、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）。除B组OST、ALP及Ⅰ型胶原相对表达量无诱导培养与成骨诱导培养比较差异无统计学意义（P＞0.05）外，其余各组基因相对表达量成骨诱导培养均高于无诱导培养（P＜0.05）。见图 6。
图6
各组成骨诱导及无诱导10 d实时荧光定量PCR检测各基因表达 ⓐRunx2 ⓑOST ⓒALP ⓓⅠ型胶原图 7 各组成骨诱导及无诱导10 d Western blot检测各蛋白表达1：A组2：B组3：C组4：D组 ⓐ成骨诱导 ⓑ无诱导图 8 各组成骨诱导及无诱导10 d Western blot检测各蛋白表达量 ⓐALP ⓑOST
Figure6.
Real-time fluorescent quantitative PCR detection for osteoblast genes expressions after osteogenic induced or non-induced culture for 10 days ⓐRunx2 ⓑOST ⓒALP ⓓCollagen type I Fig.7 Western blot detection for osteoblast proteins expressions after osteogenic induced or non-induced culture for 10 days 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D ⓐOsteogenic induced culture ⓑNon-induced culture Fig.8 Western blot detection for osteoblast proteins expressions after osteogenic induced or non-induced culture for 10 days ⓐALP ⓑOST
2.2.4 Western blot检测
成骨诱导培养10 d，A组ALP和OST蛋白表达量明显高于其余3组，C、D组高于B组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；C、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）。无诱导培养10 d，A组ALP蛋白表达量明显高于其余3组，C、D组高于B组，差异均有统计学意义（P＜0.05），C、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）；A组OST蛋白表达量高于其余3组，C组高于B组，差异均有统计学意义（P＜0.05），B、D组间及C、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）。成骨诱导各组ALP和OST蛋白表达量均显著高于无诱导培养各组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 7、8。
2.3 成脂相关检测
2.3.1 油红O染色
成脂诱导培养14 d，B、C、D组见大量深染红色区域，呈强阳性表现，其中B组最强；A组散在小团状着色区，数量较其他组明显减少（图 9）。无诱导培养示，B组见较少典型红色团块状着色区，C组见极少小团状着色区，A、D组呈阴性（图 10）。
图9
各组成脂诱导14 d油红O染色（× 200） ⓐA组 ⓑB组 ⓒC组 ⓓD组图 10各组无成脂诱导14 d油红O染色（× 200） ⓐA组 ⓑB组 ⓒC组 ⓓD组
Figure9.
Oil red O staining observation after adipogenic induced culture for 14 days (× 200) ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C ⓓGroup D Fig.10 Oil red O staining observation after non-induced culture for 14 days (× 200) ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C ⓓGroup D
2.3.2 实时荧光定量PCR检测
成脂诱导培养10 d，A组C/EBPβ、PPARγ、C/EBPα和FABP4 mRNA相对表达量均低于B、C、D组，差异有统计学意义（P＜0.05）；除C/EBPβ外，B组PPARγ、C/EBPα、FABP4 mRNA相对表达量均高于C、D组，差异有统计学意义（P＜0.05）；除FABP4外，C、D组C/EBPβ、PPARγ、C/EBPα mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。无诱导培养10 d，B组PPARγ mRNA相对表达量高于A、C、D组，C、D组高于A组，差异有统计学意义（P＜0.05），C、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）；FABP4、C/EBPβ和C/EBPα mRNA相对表达量各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。成脂诱导培养各组PPARγ mRNA相对表达量均高于无诱导培养（P＜0.05）；除A组外，B、C、D组FABP4、C/EBPβ和C/EBPα mRNA相对表达量均高于无诱导培养（P＜0.05）。见图 11。
图11
各组成脂诱导及无诱导10 d实时荧光定量PCR检测各基因表达 ⓐPPARγ ⓑC/EBPα ⓒFABP4 ⓓC/EBPβ 图 12 各组成脂诱导及无诱导10 d Western blot检测各蛋白表达1：A组2：B组3：C组4：D组 ⓐ成脂诱导 ⓑ无诱导图 13各组成脂诱导及无诱导10 d Western blot检测各蛋白表达量 ⓐPPARγ ⓑFABP4
Figure11.
Real-time fluorescent quantitative PCR detection for adipocyte genes expressions after adipogenic induced or non-induced culture for 10 days ⓐPPARγ ⓑC/EBPα ⓒFABP4 ⓓC/EBPβ Fig.12 Western blot detection for adipocyte proteins expressions after adipogenic induced or non-induced culture for 10 days 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D ⓐAdipogenic induced culture ⓑNon-induced culture Fig.13 Western blot detection for adipocyte proteins expressions after adipogenic induced or non-induced culture for 10 days ⓐPPARγ ⓑFABP4
2.3.3 Western blot检测
成脂诱导培养10 d，B组PPARγ和FABP4蛋白表达量明显高于其余3组，C、D组高于A组，差异均有统计学意义（P＜0.05），C、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）。无诱导培养10 d，B组FABP4蛋白表达量明显高于其余3组，C、D组高于A组，差异均有统计学意义（P＜0.05），C、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）；各组间PPARγ蛋白表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。除A组PPARγ外，各组PPARγ和FABP4蛋白表达量成脂诱导培养均高于无诱导培养（P＜0.05）。见图 12、13。
3 讨论
ALP是BMSCs早期成骨分化的重要标志，在细胞外基质矿化过程中有重要作用；茜素红染色利用沉积的钙与茜素红发生显色反应，呈现红褐色的染色效果。这两个检测结果分别对成骨分化的早期和晚期具有重要意义。油红O遇到脂滴显现红色，其他组织则很少显色，通过油红O可很好地判断成脂分化情况。本实验上述染色结果显示：成骨诱导后A组茜素红染色强阳性，B组则为弱阳性，成脂诱导后油红O染色则相反。说明Wnt10b表达促进hBMSCs成骨分化，抑制其成脂分化；而Wnt10b表达被干扰，则促进hBMSCs成脂分化，抑制其成骨分化。
本实验实时荧光定量PCR检测结果示：成骨诱导培养的成骨转录因子Runx2、OST、ALP、Ⅰ型胶原和成脂诱导培养的成脂转录因子PPARγ、FABP4、C/EBPα的表达水平明显高于无诱导培养；其中上述成骨转录因子A组表达水平高于D组，成脂转录因子表达水平低于D组，B组则与A组相反。说明hBMSCs成骨成脂分化时，相应转录因子表达升高，Wnt10b通过改变转录因子的表达水平对hBMSCs成骨成脂分化进行调控。这与Bennett等[16]对ST2细胞研究的结果相似，他们通过Wnt10b基因表达逆转录病毒转染ST2细胞的实验研究认为，Wnt10b基因通过调控多能干细胞自身表达的成骨成脂转录因子来决定其分化方向，包括上调成骨因子Twist、Runx2、Dlx5和OST，抑制成脂因子PPARγ、C/EBPα和FABP4。本实验还发现成骨转录因子ALP和Ⅰ型胶原表达的变化也与上述转录因子一致。另外，本实验结果显示：成脂转录因子C/ EBPβ变化不明显，原因可能是C/EBPβ为hBMSCs成骨成脂分化的早期调节因子[20]，本研究检测时间相对较晚，其表达水平已下降，因而未出现统计学差异。
Western blot检测结果示：成骨相关ALP、OST蛋白和成脂相关FABP4和PPARγ蛋白的表达水平检测结果基本一致，即hBMSCs成骨诱导分化时，成骨相关蛋白的表达A组高于D组，B组低于D组；成脂分化时，成脂相关蛋白的表达则相反。说明hBMSCs成骨成脂分化时Wnt10b正向调控成骨相关ALP、OST蛋白的表达，负向调控成脂相关FABP4和PPARγ蛋白的表达。从而从蛋白水平进一步说明，Wnt10b通过调控成骨成脂转录因子和蛋白的表达来实现对hBMSCs成骨成脂分化的调控。
另外，本实验结果示，在无诱导培养下，A组出现成骨检测阳性，B组出现成脂检测阳性，相应D组结果为阴性；并且实时荧光定量PCR和Western blot检测结果示，无诱导培养下，A组成骨转录因子表达高于D组，成脂转录因子表达低于D组，B组则相反。提示单纯Wnt10b基因表达水平的变化能够使hBMSCs向成骨成脂方向分化，即Wnt10b高表达能够始发hBMSCs成骨分化，表达抑制能够始发hBMCSs成脂分化。但由于hBMSCs在成骨成脂诱导培养下，单纯Wnt10b基因表达水平的改变未出现hBMSCs分化方向的逆转，说明hBMSCs成骨成脂分化的调控还存在其他影响因素，这仍需进一步研究。
MSCs是成骨细胞和脂肪细胞共同的前体细胞[1]。体外研究发现，诱导MSCs成骨分化的因素会抑制其成脂分化[2]，这与病理学及流行病学发现的老龄化、骨丢失和骨质疏松伴随骨髓内脂肪组织增加一致[3-4]。目前体内外实验均支持“细胞系竞争”的学说，即骨内以牺牲成骨为代价的脂肪细胞增多，是导致骨质疏松症等骨丢失性疾病骨量减少的重要原因之一[5-7]。但是MSCs成骨-成脂反向分化的具体细胞学机制还不清楚。
随着对骨代谢机制研究的深入，Wnt信号通路所起关键作用引起广泛关注，特别是经典Wnt信号通路[8-11]。研究发现，Wnt10b基因在调控MSCs成骨成脂分化中起关键作用，Wnt10b有可能成为治疗骨丢失和/或肥胖相关疾病的新手段[12-14]。目前通过转基因鼠对Wnt10b的研究较为集中，最早Longo等[13]发现脂肪型脂肪酸结合蛋白4（adipocyte fatty acid binding protein 4，FABP4）启动子调控下的Wnt10b过表达转基因鼠（FABP4-Wnt10b鼠）出现骨量和骨强度的增加，并且阻止因年龄和激素导致的骨量丢失[15]；而敲除Wnt10b基因鼠（Wnt10b-/-鼠）因骨小梁数量减少和间隔增大，导致骨体积和骨密度降低了30%。敲除低密度脂蛋白受体相关蛋白5基因鼠（LRP5-/-鼠）也出现了类似表现，原因可能是内源性Wnt10b信号的减少[16-17]。骨钙素（osteocalcin，OST）启动子调控的Wnt10b基因过表达鼠（OST-Wnt10b鼠）骨量增加约75%，并且与野生鼠相比成骨细胞数量明显增加，但破骨细胞无明显改变[18]。杂合子Wnt10b鼠（Wnt10b+/-鼠）6个月时出现骨小梁明显减少，成骨细胞功能减退和数量减少，但破骨细胞未受到明显影响。更重要的是Wnt10b还具有维持MSCs自我更新及MSCs数量的能力，Wnt10b可以决定MSCs的命运[19]，进一步说明Wnt10b在调控MSCs成骨成脂分化中起关键作用。但体外细胞实验研究相对较少，目前尚未见采用人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）进行的相关实验研究。本研究旨在进一步探索Wnt10b基因调控hBMSCs成骨成脂分化的分子机制以及Wnt10b基因是否对hBMSCs也具有类似作用，为探索Wnt10b调控hBMSCs成骨成脂分化提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 Wnt10b基因表达腺病毒载体构建与转染效率检测
1.1.1 Wnt10b基因表达腺病毒载体的构建
采用PCR扩增Wnt10b基因CDS区，并在上游引入BamHⅠ酶切点，下游引入EcoRⅠ酶切点。引物序列：Wnt10b上游5'-CGGGATCCGCCACCATGCTGGAGG-AGCCCCGG-3'，下游5'-GGAATTCTCACTTACACAC-ATTCACCCACTCT-3'。产物纯化后双酶切基因片段，再将酶切后的Wnt10b基因片段和pYr-adshuttle-1载体带进行连接，连接产物予以转化大肠杆菌感受态细胞进行重组质粒的扩增和提取。
1.1.2 Wnt10b基因沉默（Wnt10b-shRNA）腺病毒载体的构建
根据shRNA靶点的选择原则，从TRC shRNA数据库中择优选取3条Wnt10b-shRNA序列作为待筛靶序列，设计并合成Wnt10b-shRNA引物：Wnt10b-shRNA-83上游5'-CACCCGGGCTCTAAGCAATGAG-ATTCTCGAGAATCTCATTGCTTAGAGCCCGTTT-TTTG-3'，下游5'-AGCTCAAAAAACGGGCTCTAAG-CAATGAGATTCTCGAGAATCTCATTGCTTAGAG-CCCG-3'；Wnt10b-shRNA-84上游5'-CACCCTTTGAG-AAGTCTCCTGACTTCTCGAGAAGTCAGGAGACT-TCTCAAAGTTTTTTG-3'，下游5'-AGCTCAAAAAAC-TTTGAGAAGTCTCCTGACTTCTCGAGAAGTCA-GGAGACTTCTCAAAG-3'；Wnt10b-shRNA-87上游5'-
CACCCGGTTTCCGAGAAAGTGCTTTCTCGA-GAAAGCACTTTCTCGGAAACCGTT-TTTTG-3'，下游5'-AGCTCAAAAAACGGTTTCCGAGAAAGTGCTTTCTCGAGAAAGCACTTTCTCGGAA-ACCG-3'。将合成引物分别与BsaⅠ（NEB）酶切后的pYr-1.1连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞进行重组质粒的扩增和提取。
1.1.3 所构建病毒载体转染效率检测
选取HEK293细胞作为转染对象，以未行任何处理的HEK293细胞为空白对照（NC组），以pYr-1.1-HK质粒（空质粒）转染的HEK293细胞为阴性对照组（HK组），以pYr-adshuttle-1-Wnt10b质粒转染的HEK293细胞为阳性对照组（Wnt10b组），以pYr-1.1-hWnt10b-shRNA-83、pYr-1.1-hWnt10b-shRNA-84、pYr-1.1-hWnt10b-shRNA-87 3个质粒转染的HEK293细胞为实验组（分别为83干扰组、84干扰组和87干扰组），分别予以相应处理后行RT-PCR检测，引物对：Wnt10b-F196：5'-CACTGTCCCGAGGCAAGAG-3'，Wnt10b-R196：5'-TTGTGGATTCGCATTCGTG-3'，GAPDH-F452：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，GAPDH-R452：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。
1.1.4 病毒包装
通过LR体外同源重组将穿梭载体pYr-adshuttle-1-Wnt10b和干扰效果最好的质粒表达框构建至pAd/PL-DEST腺病毒表达载体上，PacⅠ酶切重组腺病毒质粒并转染HEK293细胞，进行重组腺病毒的扩增，半数组织培养感染剂量法检测重组腺病毒感染性滴度。
1.2 hBMSCs分离培养
骨髓样本来源于四川大学华西医院骨科4例住院患者，研究通过医院伦理委员会批准，患者均知情同意。其中男3例，女1例；年龄20～40岁。均为因创伤需行取髂骨植骨手术者，术前检查证实无造血系统及肿瘤等疾患；全麻下手术，取髂骨时使用无菌注射器收集溢出的骨髓液，采用密度梯度离心法获取hBMSCs，置于完全培养基（含10%FBS的DMEM培养基）中，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱内培养并传代，取第4代细胞进行实验。
1.3 实验分组及检测指标
取第4代hBMSCs，以5 × 106个/mL浓度接种于含完全培养基的T-75培养瓶中，当生长达80%融合后，将培养瓶中一部分hBMSCs消化转移至含载玻片的6孔培养板，行ALP、茜素红染色和油红O染色；另一部分细胞行实时荧光定量PCR和Western blot检测。实验分为4组，A、B、C组分别加入Wnt10b基因表达腺病毒载体、Wnt10b-shRNA腺病毒载体和空病毒转染细胞，D组细胞不进行转染作为空白对照组。
1.3.1 成骨相关检测
①ALP和茜素红染色：取各组细胞，加入成骨诱导培养基（含10%FBS、0.1 μmol/L地塞米松、50 μmol/L抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠的DMEM培养基）培养，7 d后行ALP染色观察，14 d后行茜素红染色观察，并与各组未诱导细胞进行比较。
②实时荧光定量PCR检测：取成骨诱导后10 d各组细胞，采用实时荧光定量PCR检测成骨相关基因Runx2、OST、ALP及Ⅰ型胶原的相对表达量，并与未诱导细胞进行比较。RNA提取后，采用随机引物利用逆转录酶逆转录成cDNA，采用Revert AidTM Frist Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司，加拿大）进行扩增。引物由成都立康科技有限公司提供；反应体系：10 × buffer（Mg2+ free）3 µL、MgCl2（25 mmol/ L）3 µL、dNTP（25 mmol/L）0.36 µL、上游引物（10 µmol/ L）1 µL、下游引物（10 µmol/L）1 µL、Taq酶（5 U/µL）0.3 µL、ddH2O 15.34 µL、cDNA模板5 µL。扩增条件：94℃、2 min；94℃、20 s，56℃、30 s，60℃、40 s，30个循环；72℃延伸5 min。分析绘制扩增动力学曲线，根据动力学曲线确定每个样品管中荧光强度增加到某一特定阈值时的扩增循环数（Ct值），通过2-ΔΔCt公式计算相对表达量。
③Western blot检测：取成骨诱导后10 d各组细胞，采用Western blot法检测成骨相关蛋白ALP、OST表达，并与未诱导细胞进行比较。于冰上裂解提取细胞总蛋白，配置SDS-PAGE胶，将蛋白质转印至聚偏氟乙烯膜表面，用含10%脱脂奶粉的TBS缓冲液于37℃封闭60 min，加入一抗（1∶500），脱色摇床摇1 h；TBS缓冲液冲洗4次，加入二抗（1∶1 000），脱色摇床摇1 h；TBS缓冲液冲洗4次，用ECL试剂盒进行化学发光检测，ECL A、B液等体积混合滴于膜上，5 min后暗室压片、曝光、显影和定影，并行定量检测。
1.3.2 成脂相关检测
①油红O染色：取各组细胞，加入成脂诱导培养基（含10%FBS、1 μmol/L地塞米松、10 μmol/L胰岛素、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、200 μmol/L吲哚美辛的DMEM培养基）培养，14 d后行油红O染色，并与各组未诱导细胞进行比较。
②实时荧光定量PCR检测：取成脂诱导后10 d各组细胞，同1.3.1方法采用实时荧光定量PCR检测成脂相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）、CCAAT增强子结合蛋白α（CCAAT enhancer binding protein α，C/EBPα）、C/EBPβ、FABP4的相对表达量，并与未诱导细胞进行比较。
③Western blot检测：取成脂诱导后10 d各组细胞，同1.3.1方法采用Western blot法检测成脂相关蛋白PPARγ和FABP4表达，并与未诱导细胞进行比较。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 病毒载体转染效率检测
结果显示Wnt10b组Wnt10b基因显著表达，84干扰组和87干扰组Wnt10b基因的表达明显受到干扰，其中87干扰组即pYr-1.1-hWnt10b-shRNA-87干扰效果最好。见图 1。所构建病毒滴度为5 × 109 PFU/mL。
图1
RT-PCR检测病毒载体转染效率1：NC组2：HK组3：Wnt10b组4：83干扰组5：84干扰组6：87干扰组
Figure1.
Transfection efficiency of virus vector by RT-PCR detection 1: NC group 2: HK group 3: Wnt10b group 4: 83 interference group 5: 84 interference group 6: 87 interference group
2.2 成骨相关检测
2.2.1 ALP染色
成骨诱导培养7 d，4组ALP染色均为阳性，其中A组呈强阳性，B组染色最弱（图 2）；无诱导培养7 d，A组ALP染色呈弱阳性，其余3组均为阴性（图 3）。
图2
各组成骨诱导7 d ALP染色（× 200） ⓐA组 ⓑB组 ⓒC组 ⓓD组 图 3 各组无成骨诱导7 d ALP染色（× 200） ⓐA组 ⓑB组 ⓒC组 ⓓD组 图 4 各组成骨诱导14 d茜素红染色（× 200） ⓐA组 ⓑB组 ⓒC组 ⓓD组 图 5 各组无成骨诱导14 d茜素红染色（× 200） ⓐA组 ⓑB组 ⓒC组 ⓓD组
Figure2.
ALP staining observation at 7 days after osteogenic induced culture (× 200) ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C ⓓGroup D Fig.3 ALP staining observation at 7 days after non-induced culture (× 200) ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C ⓓGroup DFig.4 Alizarin red staining observation at 14 days after osteogenic induced culture (× 200) ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C ⓓGroup DFig.5 Alizarin red staining observation at 14 days after non-induced culture (× 200) ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C ⓓGroup D
2.2.2 茜素红染色
成骨诱导培养14 d，A组出现大量片状融合褐色矿化结节，B组见少许点状褐色矿化结节，C、D组出现大量点状褐色矿化结节（图 4）；无诱导培养14 d，A组可见大量点状褐色矿化结节，C、D组偶见不典型矿化结节，B组几乎未见矿化结节（图 5）。
2.2.3 实时荧光定量PCR检测
成骨诱导培养10 d，A组Runx2、OST、ALP及Ⅰ型胶原mRNA相对表达量均显著高于B、C、D组，差异有统计学意义（P＜0.05）；除Runx2外，B组OST、ALP及Ⅰ型胶原mRNA相对表达量均显著低于C、D组，差异有统计学意义（P＜0.05）；C、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）。除B组OST、ALP及Ⅰ型胶原相对表达量无诱导培养与成骨诱导培养比较差异无统计学意义（P＞0.05）外，其余各组基因相对表达量成骨诱导培养均高于无诱导培养（P＜0.05）。见图 6。
图6
各组成骨诱导及无诱导10 d实时荧光定量PCR检测各基因表达 ⓐRunx2 ⓑOST ⓒALP ⓓⅠ型胶原图 7 各组成骨诱导及无诱导10 d Western blot检测各蛋白表达1：A组2：B组3：C组4：D组 ⓐ成骨诱导 ⓑ无诱导图 8 各组成骨诱导及无诱导10 d Western blot检测各蛋白表达量 ⓐALP ⓑOST
Figure6.
Real-time fluorescent quantitative PCR detection for osteoblast genes expressions after osteogenic induced or non-induced culture for 10 days ⓐRunx2 ⓑOST ⓒALP ⓓCollagen type I Fig.7 Western blot detection for osteoblast proteins expressions after osteogenic induced or non-induced culture for 10 days 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D ⓐOsteogenic induced culture ⓑNon-induced culture Fig.8 Western blot detection for osteoblast proteins expressions after osteogenic induced or non-induced culture for 10 days ⓐALP ⓑOST
2.2.4 Western blot检测
成骨诱导培养10 d，A组ALP和OST蛋白表达量明显高于其余3组，C、D组高于B组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；C、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）。无诱导培养10 d，A组ALP蛋白表达量明显高于其余3组，C、D组高于B组，差异均有统计学意义（P＜0.05），C、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）；A组OST蛋白表达量高于其余3组，C组高于B组，差异均有统计学意义（P＜0.05），B、D组间及C、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）。成骨诱导各组ALP和OST蛋白表达量均显著高于无诱导培养各组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 7、8。
2.3 成脂相关检测
2.3.1 油红O染色
成脂诱导培养14 d，B、C、D组见大量深染红色区域，呈强阳性表现，其中B组最强；A组散在小团状着色区，数量较其他组明显减少（图 9）。无诱导培养示，B组见较少典型红色团块状着色区，C组见极少小团状着色区，A、D组呈阴性（图 10）。
图9
各组成脂诱导14 d油红O染色（× 200） ⓐA组 ⓑB组 ⓒC组 ⓓD组图 10各组无成脂诱导14 d油红O染色（× 200） ⓐA组 ⓑB组 ⓒC组 ⓓD组
Figure9.
Oil red O staining observation after adipogenic induced culture for 14 days (× 200) ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C ⓓGroup D Fig.10 Oil red O staining observation after non-induced culture for 14 days (× 200) ⓐGroup A ⓑGroup B ⓒGroup C ⓓGroup D
2.3.2 实时荧光定量PCR检测
成脂诱导培养10 d，A组C/EBPβ、PPARγ、C/EBPα和FABP4 mRNA相对表达量均低于B、C、D组，差异有统计学意义（P＜0.05）；除C/EBPβ外，B组PPARγ、C/EBPα、FABP4 mRNA相对表达量均高于C、D组，差异有统计学意义（P＜0.05）；除FABP4外，C、D组C/EBPβ、PPARγ、C/EBPα mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。无诱导培养10 d，B组PPARγ mRNA相对表达量高于A、C、D组，C、D组高于A组，差异有统计学意义（P＜0.05），C、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）；FABP4、C/EBPβ和C/EBPα mRNA相对表达量各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。成脂诱导培养各组PPARγ mRNA相对表达量均高于无诱导培养（P＜0.05）；除A组外，B、C、D组FABP4、C/EBPβ和C/EBPα mRNA相对表达量均高于无诱导培养（P＜0.05）。见图 11。
图11
各组成脂诱导及无诱导10 d实时荧光定量PCR检测各基因表达 ⓐPPARγ ⓑC/EBPα ⓒFABP4 ⓓC/EBPβ 图 12 各组成脂诱导及无诱导10 d Western blot检测各蛋白表达1：A组2：B组3：C组4：D组 ⓐ成脂诱导 ⓑ无诱导图 13各组成脂诱导及无诱导10 d Western blot检测各蛋白表达量 ⓐPPARγ ⓑFABP4
Figure11.
Real-time fluorescent quantitative PCR detection for adipocyte genes expressions after adipogenic induced or non-induced culture for 10 days ⓐPPARγ ⓑC/EBPα ⓒFABP4 ⓓC/EBPβ Fig.12 Western blot detection for adipocyte proteins expressions after adipogenic induced or non-induced culture for 10 days 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D ⓐAdipogenic induced culture ⓑNon-induced culture Fig.13 Western blot detection for adipocyte proteins expressions after adipogenic induced or non-induced culture for 10 days ⓐPPARγ ⓑFABP4
2.3.3 Western blot检测
成脂诱导培养10 d，B组PPARγ和FABP4蛋白表达量明显高于其余3组，C、D组高于A组，差异均有统计学意义（P＜0.05），C、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）。无诱导培养10 d，B组FABP4蛋白表达量明显高于其余3组，C、D组高于A组，差异均有统计学意义（P＜0.05），C、D组间差异无统计学意义（P＞0.05）；各组间PPARγ蛋白表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。除A组PPARγ外，各组PPARγ和FABP4蛋白表达量成脂诱导培养均高于无诱导培养（P＜0.05）。见图 12、13。
3 讨论
ALP是BMSCs早期成骨分化的重要标志，在细胞外基质矿化过程中有重要作用；茜素红染色利用沉积的钙与茜素红发生显色反应，呈现红褐色的染色效果。这两个检测结果分别对成骨分化的早期和晚期具有重要意义。油红O遇到脂滴显现红色，其他组织则很少显色，通过油红O可很好地判断成脂分化情况。本实验上述染色结果显示：成骨诱导后A组茜素红染色强阳性，B组则为弱阳性，成脂诱导后油红O染色则相反。说明Wnt10b表达促进hBMSCs成骨分化，抑制其成脂分化；而Wnt10b表达被干扰，则促进hBMSCs成脂分化，抑制其成骨分化。
本实验实时荧光定量PCR检测结果示：成骨诱导培养的成骨转录因子Runx2、OST、ALP、Ⅰ型胶原和成脂诱导培养的成脂转录因子PPARγ、FABP4、C/EBPα的表达水平明显高于无诱导培养；其中上述成骨转录因子A组表达水平高于D组，成脂转录因子表达水平低于D组，B组则与A组相反。说明hBMSCs成骨成脂分化时，相应转录因子表达升高，Wnt10b通过改变转录因子的表达水平对hBMSCs成骨成脂分化进行调控。这与Bennett等[16]对ST2细胞研究的结果相似，他们通过Wnt10b基因表达逆转录病毒转染ST2细胞的实验研究认为，Wnt10b基因通过调控多能干细胞自身表达的成骨成脂转录因子来决定其分化方向，包括上调成骨因子Twist、Runx2、Dlx5和OST，抑制成脂因子PPARγ、C/EBPα和FABP4。本实验还发现成骨转录因子ALP和Ⅰ型胶原表达的变化也与上述转录因子一致。另外，本实验结果显示：成脂转录因子C/ EBPβ变化不明显，原因可能是C/EBPβ为hBMSCs成骨成脂分化的早期调节因子[20]，本研究检测时间相对较晚，其表达水平已下降，因而未出现统计学差异。
Western blot检测结果示：成骨相关ALP、OST蛋白和成脂相关FABP4和PPARγ蛋白的表达水平检测结果基本一致，即hBMSCs成骨诱导分化时，成骨相关蛋白的表达A组高于D组，B组低于D组；成脂分化时，成脂相关蛋白的表达则相反。说明hBMSCs成骨成脂分化时Wnt10b正向调控成骨相关ALP、OST蛋白的表达，负向调控成脂相关FABP4和PPARγ蛋白的表达。从而从蛋白水平进一步说明，Wnt10b通过调控成骨成脂转录因子和蛋白的表达来实现对hBMSCs成骨成脂分化的调控。
另外，本实验结果示，在无诱导培养下，A组出现成骨检测阳性，B组出现成脂检测阳性，相应D组结果为阴性；并且实时荧光定量PCR和Western blot检测结果示，无诱导培养下，A组成骨转录因子表达高于D组，成脂转录因子表达低于D组，B组则相反。提示单纯Wnt10b基因表达水平的变化能够使hBMSCs向成骨成脂方向分化，即Wnt10b高表达能够始发hBMSCs成骨分化，表达抑制能够始发hBMCSs成脂分化。但由于hBMSCs在成骨成脂诱导培养下，单纯Wnt10b基因表达水平的改变未出现hBMSCs分化方向的逆转，说明hBMSCs成骨成脂分化的调控还存在其他影响因素，这仍需进一步研究。
