引用本文： 甘洪全, 李琪佳, 王茜, 路建, 耿丽鑫, 宋会平, 王志强. 国产多孔钽材料兔髌腱内植入形态学特点及生物相容性评价. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(4): 452-456. doi: 10.7507/1002-1892.20140103 复制
恶性肿瘤及外伤等因素造成的关节部位骨损伤会破坏肌腱-骨连接装置，造成关节功能丧失[1-2]。人工关节置换术是治疗此类损伤的常用方法之一。关节置换后要求肌腱与假体之间具有强大持久的附着力及连接力，以维持关节稳定性[3-5]。因此肌腱与假体连接问题成为肌腱-骨连接装置损伤研究的热点。临床常用的肌腱-骨连接装置重建方法存在肌腱负荷难以控制、不能长期坚强固定、术后并发症多等缺点。研究发现，多孔钽具备稳定的生物相容性、较大的摩擦系数及机械强度，弹性模量接近正常人骨，而且具有较高的孔径及孔隙连通率[6-7]，有利于宿主组织向其孔隙内生长，达到稳定固定，目前已作为髋、膝关节假体材料用于临床[8-10]。多孔钽这些特性使其用于重建肌腱-骨界面连接装置成为可能。然而目前国内临床使用的多孔钽材料均为国外进口，价格昂贵。重庆润泽医疗器械有限公司联合国内多家科研机构，采用粉末浇注高温煅烧工艺技术成功研制了多孔钽材料。本实验通过将该国产多孔钽材料植入兔髌腱内，观察肌腱组织向多孔钽孔隙内生长情况，评价其生物相容性，并与已广泛应用于临床的多孔钛材料进行比较，为国产多孔钽材料应用于临床提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
成年新西兰大白兔48只，雌雄不限，体重2.5～ 3.0 kg，由河北联合大学实验动物中心提供。
多孔钽材料由重庆润泽医疗器械有限公司提供，材料呈深灰色，表面光洁，表面及横断面可见蜂窝状针尖大小的孔，分布均匀；多孔钛材料由陕西宝鸡金凯科技工贸有限公司提供，材料呈浅灰色，表面粗糙呈颗粒状，表面及横断面亦可见蜂窝状孔隙（图 1）。E-1010离子溅射装置（Hitachi公司，日本）；JSM-6030LV扫描电镜（日本电子株式会社）；Minimet1000磨片机（Buehler公司，美国）；SP2600铣片机、Leica1600硬组织切片机（Leica公司 德国）。
1.2 实验分组及方法
取48只新西兰大白兔，以腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，仰卧位固定，双膝部剃毛暴露术区。作膝关节外侧纵切口，切开皮肤及皮下筋膜，沿髌腱冠状面纵行劈开，将大小为5 mm × 5 mm × 2 mm的多孔钽材料及多孔钛材料分别植入左、右侧髌腱，作为实验组及对照组。用缝合线按“#”形将材料固定于髌腱，缝合髌腱、皮下筋膜及皮肤。术后肌肉注射头孢尼西钠预防感染，每天0.1 g，共3 d。动物均自由活动。术后2、4、8、12周各取12只动物进行观察。
1.3 观察指标
1.3.1 大体观察
观察术后动物存活、切口愈合情况及肢体活动情况。各时间点取12只实验动物，空气栓塞处死后按原切口入路，将植入材料连同周围髌腱组织一并切取，观察植入材料周围有无红肿、化脓，材料与周围组织结合是否紧密。
1.3.2 组织学观察
各时间点大体观察后取其中4 只实验动物标本，分离周围髌腱组织，取出植入材料，行 石蜡包埋、切片后HE染色。光镜观察植入材料周围包膜形成以及细胞浸润情况。在100倍镜下，每张切片取3个视野，采用镜下测微尺测量包膜厚度，取均 值。
1.3.3 扫描电镜观察
各时间点大体观察后取2只实验动物标本，同1.3.2方法取出植入材料，4%戊二醛固定，梯度乙醇逐级脱水，37℃电热恒温鼓风干燥箱内烘干，离子溅射装置喷金，扫描电镜观察植入材料内髌腱组织长入情况。
1.3.4 硬组织切片观察
各时间点大体观察后取6只实验动物标本，切取植入材料连同周围1 cm髌腱组织，4%甲醛固定后脱水、渗透、包埋及聚合，真空处理；取出包埋块，抛光切面，硬组织切片机切片，切出能将多孔钽和多孔钛完整暴露的平面，制成70 μm厚切片，磨片至20 μm厚，干燥，脱塑。甲苯胺蓝染色，空气干燥，中性树胶封片。光镜下观察植入材料内髌腱组织长入情况。
1.4 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，组内不同时间点间比较采用单因素方差分析；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大体观察
术后动物均存活至实验完成，切口愈合好；3 d后膝关节活动即恢复正常。大体观察显示，各时间点两组多孔钽及多孔钛材料与髌腱组织均结合紧密，未见明显红肿、化脓等炎性反应。
2.2 组织学观察
术后2、4周，两组植入材料周围均有包膜形成，包膜内可见成纤维细胞及新生毛细血管，交界面可见少量淋巴细胞浸润，未见多核巨噬细胞及各类白细胞浸润；8、12周；两组包膜与2、4周相比更致密，且变薄，成纤维细胞及血管明显减少。各时间点两组形成的包膜与周围肌腱组织结合均较紧密（图 2）。各时间点对照组包膜均较实验组疏松、厚，但两组包膜厚度比较差异均无统计学意义（P＞ 0.05）；随时间延长，两组包膜均逐渐变薄，组内各时间点间比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见表 1。
表1
各时间点两组包膜厚度比较（n=4，μm，2.3 扫描电镜观察
术后2周，两组均见少量肌腱胶原纤维长入孔隙内部，部分胶原纤维附着于孔壁，未附着部分可见孔隙空虚或缝隙。4、8周，两组胶原纤维及纤维细胞在孔隙内部大量生长，细胞形态多样、伸展、拉长或伸出突起，部分横跨孔隙相互连接；实验组多孔钽材料内纤维组织的长入多于对照组多孔钛材料，且仍可见部分间隙无肌腱组织长入。12周，两组植入材料孔隙内均充满肌腱纤维，与孔壁结合紧密，无缝隙存在；实验组孔隙内肌腱组织的长入量较对照组更多。见图 3。
图1
两种材料外观 左侧为多孔钛，右侧为多孔钽 2.4 硬组织切片观察
术后2周，两组植入材料孔隙内有疏松纤维组织及少量成纤维细胞长入，同时伴新生毛细血管。4周，实验组钽-肌腱界面新生肌腱组织增多并大量长入孔隙内，小血管及成纤维细胞较前增加；对照组观察情况与实验组相似，但多孔钛材料孔隙长入的肌腱纤维及小血管明显较少。8、12周，实验组多孔钽材料表面和孔隙内已长满新生肌腱组织，肌腱纤维呈束状排列，小血管及细胞减少，肌腱胶原纤维-多孔钽融合于一体；对照组与实验组相比肌腱组织长入无明显差异。见图 4。
3 讨论
目前，在多孔钽材料的研制和开发方面趋于世界领先地位的是美国Zimmer公司，其研发的多孔钽材料孔隙连接率高达75%～85%，孔径为400～600 μm。由于其为专利技术，价格昂贵，很难在国内广泛使用。为解决这一问题，重庆润泽医疗器械有限公司成功研发了具有自主知识产权的国产多孔钽材料，材料孔径为400～600 μm，孔隙连接率达65%～80%，与美国Zimmer公司的多孔钽材料参数相当。多孔钛及其合金已作为骨移植替代材料在临床广泛应用，其结构特点及力学性能与多孔钽类似，为此本研究选择其作为对比材料。本实验采用的多孔钛是以纯钛粉为原料，采用传统浆料发泡法制作而成，其孔径为100～ 700 μm，孔隙连接率为40%～60%。
研究发现[11]，多孔钽具有三维立体空间结构，可促进成骨细胞黏附、分化和生长，也有利于水及营养物质在其内部运输。同时，该材料生物相容性好，摩擦系数较大，机械强度高，弹性模量接近正常人骨，而且孔径合适，孔隙连接率高，十分有利于骨及其他纤维、软骨、软组织长入[12]。由于多孔钽具有良好的骨长入特性，目前已作为骨移植替代材料修复骨缺损，如关节置换或翻修术后骨缺损、股骨头缺血性坏死后骨缺损等[13-14]。本研究拟将多孔钽植入兔髌腱，观察材料植入肌腱与骨组织之间后肌腱组织是否向其内部生长，探讨其用于重建肌腱-骨固定连接装置的可能性。
本研究观察示，多孔钽植入兔髌腱后与髌腱结合紧密且周围形成了稳定包膜，随时间延长包膜逐渐变薄，但与多孔钛周围形成的包膜比较无显著差异。包膜内及周围仅见少量淋巴细胞，未见多核巨噬细胞及各类白细胞浸润。同时扫描电镜观察示，术后2周即有少量肌腱胶原纤维长入孔隙内部，随时间延长，胶原纤维在孔隙内部大量生长，形态多样、伸展或横跨孔隙相互连接，12周时材料孔隙内充满了肌腱纤维，与孔壁结合紧密。同时由于多孔钽材料孔隙大于多孔钛材料，因此其内肌腱组织的长入量更多。提示国产多孔钽与肌腱具有良好的生物相容性，并且能促进肌腱纤维向孔隙内生长。
为进一步观察多孔钽材料中细胞种类及微观结构，本研究进行了硬组织切片技术观察，分析肌腱、血管及细胞在多孔钽表面、钽-肌腱界面及孔隙内的生长变化。结果显示：肌腱纤维在材料表面及孔隙内均有生长，钽与肌腱接触紧密。随时间延长，钽-肌腱界面新生肌腱组织增多并大量长入孔隙内，伴大量小血管及成纤维细胞，最终在多孔钽表面和孔隙内长满新生肌腱，肌腱纤维呈束状排列，肌腱胶原纤维-多孔钽紧密融合。
有研究表明，植入材料被组织包绕是机体对材料的一种“温和”反应，其包膜厚度及细胞成分的出现可反映机体对植入材料的“包容”程度，包膜越薄且致密、细胞种类越少，说明越稳定[15]。此外，假体植入修复骨缺损时，周围骨组织长入假体的量是判断假体植入后稳定性的重要指标，骨组织长入量越多，说明假体与骨组织接触越密切，假体稳定性就越高，不易松动[16-18]。根据本研究结果，结合以上报道，我们认为国产多孔钽材料具有良好的组织相容性，其高孔径及孔隙率可使更多富含血管的肌腱组织向其孔隙内部生长，使多孔钽与周围肌腱产生稳定牢固的连接及整合，有望作为肌腱与骨之间界面固定材料，将机械性固定变为生物性固定，最大限度恢复肌腱与骨的牢固连接，从而恢复关节功能。
恶性肿瘤及外伤等因素造成的关节部位骨损伤会破坏肌腱-骨连接装置，造成关节功能丧失[1-2]。人工关节置换术是治疗此类损伤的常用方法之一。关节置换后要求肌腱与假体之间具有强大持久的附着力及连接力，以维持关节稳定性[3-5]。因此肌腱与假体连接问题成为肌腱-骨连接装置损伤研究的热点。临床常用的肌腱-骨连接装置重建方法存在肌腱负荷难以控制、不能长期坚强固定、术后并发症多等缺点。研究发现，多孔钽具备稳定的生物相容性、较大的摩擦系数及机械强度，弹性模量接近正常人骨，而且具有较高的孔径及孔隙连通率[6-7]，有利于宿主组织向其孔隙内生长，达到稳定固定，目前已作为髋、膝关节假体材料用于临床[8-10]。多孔钽这些特性使其用于重建肌腱-骨界面连接装置成为可能。然而目前国内临床使用的多孔钽材料均为国外进口，价格昂贵。重庆润泽医疗器械有限公司联合国内多家科研机构，采用粉末浇注高温煅烧工艺技术成功研制了多孔钽材料。本实验通过将该国产多孔钽材料植入兔髌腱内，观察肌腱组织向多孔钽孔隙内生长情况，评价其生物相容性，并与已广泛应用于临床的多孔钛材料进行比较，为国产多孔钽材料应用于临床提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
成年新西兰大白兔48只，雌雄不限，体重2.5～ 3.0 kg，由河北联合大学实验动物中心提供。
多孔钽材料由重庆润泽医疗器械有限公司提供，材料呈深灰色，表面光洁，表面及横断面可见蜂窝状针尖大小的孔，分布均匀；多孔钛材料由陕西宝鸡金凯科技工贸有限公司提供，材料呈浅灰色，表面粗糙呈颗粒状，表面及横断面亦可见蜂窝状孔隙（图 1）。E-1010离子溅射装置（Hitachi公司，日本）；JSM-6030LV扫描电镜（日本电子株式会社）；Minimet1000磨片机（Buehler公司，美国）；SP2600铣片机、Leica1600硬组织切片机（Leica公司 德国）。
1.2 实验分组及方法
取48只新西兰大白兔，以腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，仰卧位固定，双膝部剃毛暴露术区。作膝关节外侧纵切口，切开皮肤及皮下筋膜，沿髌腱冠状面纵行劈开，将大小为5 mm × 5 mm × 2 mm的多孔钽材料及多孔钛材料分别植入左、右侧髌腱，作为实验组及对照组。用缝合线按“#”形将材料固定于髌腱，缝合髌腱、皮下筋膜及皮肤。术后肌肉注射头孢尼西钠预防感染，每天0.1 g，共3 d。动物均自由活动。术后2、4、8、12周各取12只动物进行观察。
1.3 观察指标
1.3.1 大体观察
观察术后动物存活、切口愈合情况及肢体活动情况。各时间点取12只实验动物，空气栓塞处死后按原切口入路，将植入材料连同周围髌腱组织一并切取，观察植入材料周围有无红肿、化脓，材料与周围组织结合是否紧密。
1.3.2 组织学观察
各时间点大体观察后取其中4 只实验动物标本，分离周围髌腱组织，取出植入材料，行 石蜡包埋、切片后HE染色。光镜观察植入材料周围包膜形成以及细胞浸润情况。在100倍镜下，每张切片取3个视野，采用镜下测微尺测量包膜厚度，取均 值。
1.3.3 扫描电镜观察
各时间点大体观察后取2只实验动物标本，同1.3.2方法取出植入材料，4%戊二醛固定，梯度乙醇逐级脱水，37℃电热恒温鼓风干燥箱内烘干，离子溅射装置喷金，扫描电镜观察植入材料内髌腱组织长入情况。
1.3.4 硬组织切片观察
各时间点大体观察后取6只实验动物标本，切取植入材料连同周围1 cm髌腱组织，4%甲醛固定后脱水、渗透、包埋及聚合，真空处理；取出包埋块，抛光切面，硬组织切片机切片，切出能将多孔钽和多孔钛完整暴露的平面，制成70 μm厚切片，磨片至20 μm厚，干燥，脱塑。甲苯胺蓝染色，空气干燥，中性树胶封片。光镜下观察植入材料内髌腱组织长入情况。
1.4 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，组内不同时间点间比较采用单因素方差分析；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大体观察
术后动物均存活至实验完成，切口愈合好；3 d后膝关节活动即恢复正常。大体观察显示，各时间点两组多孔钽及多孔钛材料与髌腱组织均结合紧密，未见明显红肿、化脓等炎性反应。
2.2 组织学观察
术后2、4周，两组植入材料周围均有包膜形成，包膜内可见成纤维细胞及新生毛细血管，交界面可见少量淋巴细胞浸润，未见多核巨噬细胞及各类白细胞浸润；8、12周；两组包膜与2、4周相比更致密，且变薄，成纤维细胞及血管明显减少。各时间点两组形成的包膜与周围肌腱组织结合均较紧密（图 2）。各时间点对照组包膜均较实验组疏松、厚，但两组包膜厚度比较差异均无统计学意义（P＞ 0.05）；随时间延长，两组包膜均逐渐变薄，组内各时间点间比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见表 1。
表1
各时间点两组包膜厚度比较（n=4，μm，2.3 扫描电镜观察
术后2周，两组均见少量肌腱胶原纤维长入孔隙内部，部分胶原纤维附着于孔壁，未附着部分可见孔隙空虚或缝隙。4、8周，两组胶原纤维及纤维细胞在孔隙内部大量生长，细胞形态多样、伸展、拉长或伸出突起，部分横跨孔隙相互连接；实验组多孔钽材料内纤维组织的长入多于对照组多孔钛材料，且仍可见部分间隙无肌腱组织长入。12周，两组植入材料孔隙内均充满肌腱纤维，与孔壁结合紧密，无缝隙存在；实验组孔隙内肌腱组织的长入量较对照组更多。见图 3。
图1
两种材料外观 左侧为多孔钛，右侧为多孔钽 2.4 硬组织切片观察
术后2周，两组植入材料孔隙内有疏松纤维组织及少量成纤维细胞长入，同时伴新生毛细血管。4周，实验组钽-肌腱界面新生肌腱组织增多并大量长入孔隙内，小血管及成纤维细胞较前增加；对照组观察情况与实验组相似，但多孔钛材料孔隙长入的肌腱纤维及小血管明显较少。8、12周，实验组多孔钽材料表面和孔隙内已长满新生肌腱组织，肌腱纤维呈束状排列，小血管及细胞减少，肌腱胶原纤维-多孔钽融合于一体；对照组与实验组相比肌腱组织长入无明显差异。见图 4。
3 讨论
目前，在多孔钽材料的研制和开发方面趋于世界领先地位的是美国Zimmer公司，其研发的多孔钽材料孔隙连接率高达75%～85%，孔径为400～600 μm。由于其为专利技术，价格昂贵，很难在国内广泛使用。为解决这一问题，重庆润泽医疗器械有限公司成功研发了具有自主知识产权的国产多孔钽材料，材料孔径为400～600 μm，孔隙连接率达65%～80%，与美国Zimmer公司的多孔钽材料参数相当。多孔钛及其合金已作为骨移植替代材料在临床广泛应用，其结构特点及力学性能与多孔钽类似，为此本研究选择其作为对比材料。本实验采用的多孔钛是以纯钛粉为原料，采用传统浆料发泡法制作而成，其孔径为100～ 700 μm，孔隙连接率为40%～60%。
研究发现[11]，多孔钽具有三维立体空间结构，可促进成骨细胞黏附、分化和生长，也有利于水及营养物质在其内部运输。同时，该材料生物相容性好，摩擦系数较大，机械强度高，弹性模量接近正常人骨，而且孔径合适，孔隙连接率高，十分有利于骨及其他纤维、软骨、软组织长入[12]。由于多孔钽具有良好的骨长入特性，目前已作为骨移植替代材料修复骨缺损，如关节置换或翻修术后骨缺损、股骨头缺血性坏死后骨缺损等[13-14]。本研究拟将多孔钽植入兔髌腱，观察材料植入肌腱与骨组织之间后肌腱组织是否向其内部生长，探讨其用于重建肌腱-骨固定连接装置的可能性。
本研究观察示，多孔钽植入兔髌腱后与髌腱结合紧密且周围形成了稳定包膜，随时间延长包膜逐渐变薄，但与多孔钛周围形成的包膜比较无显著差异。包膜内及周围仅见少量淋巴细胞，未见多核巨噬细胞及各类白细胞浸润。同时扫描电镜观察示，术后2周即有少量肌腱胶原纤维长入孔隙内部，随时间延长，胶原纤维在孔隙内部大量生长，形态多样、伸展或横跨孔隙相互连接，12周时材料孔隙内充满了肌腱纤维，与孔壁结合紧密。同时由于多孔钽材料孔隙大于多孔钛材料，因此其内肌腱组织的长入量更多。提示国产多孔钽与肌腱具有良好的生物相容性，并且能促进肌腱纤维向孔隙内生长。
为进一步观察多孔钽材料中细胞种类及微观结构，本研究进行了硬组织切片技术观察，分析肌腱、血管及细胞在多孔钽表面、钽-肌腱界面及孔隙内的生长变化。结果显示：肌腱纤维在材料表面及孔隙内均有生长，钽与肌腱接触紧密。随时间延长，钽-肌腱界面新生肌腱组织增多并大量长入孔隙内，伴大量小血管及成纤维细胞，最终在多孔钽表面和孔隙内长满新生肌腱，肌腱纤维呈束状排列，肌腱胶原纤维-多孔钽紧密融合。
有研究表明，植入材料被组织包绕是机体对材料的一种“温和”反应，其包膜厚度及细胞成分的出现可反映机体对植入材料的“包容”程度，包膜越薄且致密、细胞种类越少，说明越稳定[15]。此外，假体植入修复骨缺损时，周围骨组织长入假体的量是判断假体植入后稳定性的重要指标，骨组织长入量越多，说明假体与骨组织接触越密切，假体稳定性就越高，不易松动[16-18]。根据本研究结果，结合以上报道，我们认为国产多孔钽材料具有良好的组织相容性，其高孔径及孔隙率可使更多富含血管的肌腱组织向其孔隙内部生长，使多孔钽与周围肌腱产生稳定牢固的连接及整合，有望作为肌腱与骨之间界面固定材料，将机械性固定变为生物性固定，最大限度恢复肌腱与骨的牢固连接，从而恢复关节功能。
