引用本文： 刘卓, 赵峥, 张亮亮, 杨翠英, 靳兆. 肺纤维化与铁死亡的相关性分析与机制探讨. 华西医学, 2024, 39(8): 1238-1245. doi: 10.7507/1002-0179.202310269 复制
特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）是一种进行性、慢性、不可逆的肺部疾病，其症状包括肺功能不可逆下降、进行性肺瘢痕形成、间质性肺炎等[1]。既往研究表明，肺纤维化的发生和进展是由于不同刺激下肺泡上皮细胞重复损伤后的异常修复[2]。但其确切的发病机制尚不清楚。近年来，一种铁依赖性、非凋亡调节性的细胞死亡机制被发现并命名为铁死亡，广泛参与卒中、脑损伤和肿瘤的发展，然而，铁是细胞正常生理活动的必需元素，铁死亡与其他形式的细胞死亡（如凋亡、坏死和自噬）不同，是因为脂质活性氧（reactive oxygen species, ROS）的致命铁依赖性积累，其原因是细胞内铁的过度积累导致脂质过氧化升高，从而导致这种类型的细胞死亡[3]。铁死亡相关基因 GPX4 缺陷小鼠表现出更严重的博来霉素诱导的肺纤维化，而转基因小鼠的这种作用减弱，表明铁死亡可能在很大程度上促进了肺纤维化[4]。此外，研究表明，肺内铁负荷过大会导致肺纤维化和肺泡上皮细胞损伤，铁离子螯合剂如去铁胺可降低铁负荷过大引起的肺损伤程度[5]。探究铁死亡参与肺纤维化的机制有助于发现其潜在治疗靶点，因此需进一步的研究来检测铁死亡相关基因，包括与肺纤维化有关的基因。因此，本研究旨在探究肺部感染诱导的铁死亡与肺纤维化的相关性及其机制，为 IFP 的临床诊断和治疗提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 生物信息学数据获取
从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）下载 GSE150910 数据集，该数据集涵盖了 2019 年 1 月—2023 年 12 月 103 个 IPF 肺组织和 103 个正常肺组织的样本信息，患者信息如表1 所示。该数据集来自公共数据库，不需要患者同意和伦理委员会的批准。
表1
GSE150910 数据集中 IPF 及对照患者基本信息
1.2 差异表达基因（differentially expressed gene, DEG）分析
对于 GSE150910 数据集中的 RNA-seq 初始数据，Reads 计数数据采用每百万转录本（transcripts per million, TPM）进行标准化。TPM 标准化公式如下：TPM=读取计数×
1.3 铁死亡相关基因的富集分析
使用 R 3.6.1 软件中的“GO Plot”包进行基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）途径富集分析。GO 分析包括生物过程、细胞成分和分子功能。
1.4 铁死亡相关 DEG 的蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）分析和相关性分析
使用 STRING 在线数据库和 Cytoscape 3.8.1 软件分析与铁死亡相关的 DEG 之间的相互作用，将网络设置为 STRING 在线数据库中的截止点（交互评分>0.15）。节点表示基因，边表示基因之间的相互作用，绿色表示下调基因，蓝色表示上调基因。MCODE 是 Cytoscape 的应用程序，用于基因网络聚类分析，绘制关键模块。利用 R 3.6.1 软件中的“Corrplot”包（Spearman 相关分析函数）识别差异表达的嗜铁相关基因之间的相关性，检验水准 α=0.05。
1.5 随机森林法筛选枢纽基因
通过随机森林算法进一步筛选关键模块中的基因。随机森林算法是解决生物学研究中各种预测问题的一种有效而流行的分类和回归方法。对于重要指标的排序，采用随机森林算法中的平均减少基尼系数来量化哪个指标对分类精度贡献最大。平均减少基尼系数是一个重要的相关指标，因为其较高的量表明，类别衍生杂质的程度可以通过一个变量来最大程度地降低。使用 GSE150910 开发随机森林模型，筛选出的前 5 个枢纽基因用于后续研究和实验验证。
1.6 枢纽基因的动物实验验证
1.6.1 实验动物及分组
从邯郸市中心医院动物实验中心购买 24 只 8 周龄雄性 C57BL/6 小鼠，体重 20～25 g。将小鼠随机分为对照组、运动组、博来霉素组、博来霉素+运动组 4 组，每组 6 只。本研究所有程序经邯郸市中心医院伦理委员会批准［审查批号：2019 第（22）号］，研究内容和过程涉及的动物实验符合实验动物福利的伦理要求，符合《动物保护法》及相关规定。动物实验室设施的环境条件符合中国国家标准《实验动物与环境设施》（GB 14925—2020）[4]，动物饲养管理和动物实验操作符合邯郸市中心医院实验动物管理规定要求。
1.6.2 博来霉素诱导的肺纤维化动物模型
博来霉素组、博来霉素+运动组小鼠在实验程序的第 1 天麻醉下（氯胺酮 100 mg/kg 和噻嗪 10 mg/kg）经气管给药博来霉素（1.5 U/kg），建立博来霉素诱导的肺纤维化模型[5]。
1.6.3 跑步机运动测试和训练
如文献[7]所述，该实验包含跑步机适应、测试和训练，小鼠适应跑步机（15 min/d，25° 倾斜，0.2 kg/h）3 d 后，以 0.2 km/h 的起始速度，每 2.5 分钟增加 0.1 km/h 的速度进行物理测试，实验以疲劳结束（经过 10 次机械刺激，动物也不能运动）。此后，运动组和博来霉素+运动组小鼠被纳入一个为期 4 周、5 次/周、60 min/次的运动训练计划，达到最初身体测试中最高速度的 60%。最后一次训练完成后，将各组小鼠经腹腔内注射氯胺酮/噻嗪（100/10 mg/kg）安乐死，并进行颈椎脱位，收集肺组织用于后续实验。
1.6.4 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR）分析
对小鼠肺组织进行 qRT-PCR 分析，验证铁死亡标志物前列腺素内过氧化物合成酶 2 和枢纽基因，使用 TRIzol 收集每个肺组织样本的总 RNA，收集的 RNA 纯度用 Quantus 荧光仪测定，首先对总 RNA 进行逆转录反应，后将扩增的互补 DNA 样品与一步 SYBR PrimeScript PLUS RTPCR 试剂盒混合。最后，在 AriaMx HRM 系统上进行反应。该反应的阳性对照为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，每个样品采用比较循环阈值法计算。
1.7 枢纽基因的生存分析
从 GEO 数据库下载 GSE70866 数据集，该数据集包含来自 212 例 IPF 患者的基因表达谱数据和生存预后信息，用该数据集来验证枢纽基因的生存预后，用 R 3.6.1 软件对其进行生存分析。
1.8 统计学方法
使用 GraphPad Prism 8.0 和 R 3.6.1 软件进行绘图和统计分析。患者基本信息比较时，计量数据以均数±标准差表示，两组间比较采用 t 检验；计数数据以例数和/或百分数表示，组间比较采用 χ2 检验。测序数据使用 R 3.6.1 软件中的“LIMMA”包进行 DEG 分析，使用“randomForest”包进行枢纽基因筛选。采用单因素方差分析对 4 组小鼠潜在生物标志物的表达量进行统计学分析，并进行 Tukey 多重比较。采用对数秩检验分析不同枢纽基因表达水平的 IPF 患者的生存曲线差异。双侧检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 铁死亡相关 DEG
从 GEO 数据库下载 GSE150910 数据集，得到
表2
IPF 铁死亡相关 DEG
2.2 铁死亡相关 DEG 的富集途径和分析
GO 最显著的富集项包括有机阴离子转运、对缺氧的反应、对氧水平降低的响应（生物过程），基底外侧质膜、细胞皮层、膜筏（细胞成分），DNA-结合转录激活因子活性、RNA 聚合酶Ⅱ特异性、血红素结合、四氟化结合（分子功能），见图1。KEGG 富集分析结果显示，与铁死亡相关的 DEG 主要参与肾细胞癌、花生四烯酸代谢、癌症中心碳代谢、人 T 细胞白血病病毒 1 感染、百日咳、利什曼病、内分泌抵抗、恰加斯病、缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1, HIF-1）信号通路、牛磺酸和次牛磺酸代谢（图2）。
图1
20 个铁死亡相关 DEG 的 GO 富集分析
BP：生物过程；CC：细胞成分；MF：分子功能；DEG：差异表达基因；GO：基因本体论
图2
20 个铁死亡相关 DEG 的 KEGG 富集分析
DEG：差异表达基因；KEGG：京都基因和基因组数据库；FC：差异倍数；HIF-1：缺氧诱导因子-1
2.3 铁死亡相关 DEG 的 PPI 网络和相关性分析
PPI 网络分析显示铁死亡相关 DEG 之间存在相互作用（图3a）。图3b 显示了每个基因的相互作用数量。采用 Spearman 相关分析研究这些基因表达的相关性。来自 GSE150910 数据集的研究结果表明，20 个差异表达的铁死亡相关基因之间存在相互作用（图3c）。此外，利用 Cytoscape 的应用程序 MCODE 对基因网络进行聚类分析。结果，通过绘制关键模块，建立了 4 个切割基因（CAV1、JUN、NOS2、EPAS1）和 6 个凸起基因（GDF15、SLC2A1、CDKN2A、CA9、HNF4A、TP63）（图3d）。
图3
20 个铁死亡相关 DEG 的 PPI 网络分析和相关性分析
a. 20 个铁死亡相关 DEG 中的 PPI 网络；b. 各 DEG 的相互作用数；c. 20 个铁死亡相关 DEG 的 Spearman 相关性分析；d. 关键模块由 MCODE 鉴定，用于识别网络基因聚类。DEG：差异表达基因；PPI：蛋白质相互作用；绿色代表下调基因，蓝色代表上调基因
2.4 使用随机森林分类器识别关键 DEG
使用随机森林算法对 MCODE 筛选的 10 个基因进行排名，并选择前 5 个 DEG（CAV1、NOS2、GDF15、HNF4A、CDKN2A）进行进一步的分析和验证动物实验（图4）。
图4
使用随机森林分类器鉴定最重要的枢纽基因
2.5 qRT-PCR 检测潜在的生物标志物表达
筛选的肺纤维化小鼠模型生物标志物（CAV1、NOS2、GDF15、HNF4A、CDKN2A）和铁沉标志物 PDGS2 进行 qRT-PCR 验证。4 组间 HNF4A 的表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。运动训练后，与博来霉素组相比，博来霉素+运动组 CAV1、CDKN2A 表达升高，PTGS2、GDF15、NOS2 表达降低（图5）。
图5
qRT-PCR 检测潜在的生物标志物表达
qRT-PCR 检测肺纤维化小鼠模型生物标志物（
2.6 验证组中枢纽基因的生存分析
NOS2 和 GDF15 基因表达水平较高的 IPF 患者的总生存率低于这 2 个基因表达水平较低的患者（P<0.05）。此外，与高表达水平的患者相比，IPF 患者中 CAV1 和 CDKN2A 的低表达水平与较差的总生存率相关（P<0.05）。HNF4A 表达水平与 IPF 患者总生存率无关（P>0.05）。见图6。
图6
验证组 IPF 患者枢纽基因表达水平与总生存时间的 Kaplan-Meier 生存分析
a.
3 讨论
本研究确定了 IPF 中铁死亡的关键相关基因，并探讨了 IPF 中铁死亡的潜在发病机制。本研究从 GSE150910 和 FerrDb 数据集的交叉集中共获得了 20 个基因，包括 13 个上调基因和 7 个下调基因，它们之间存在显著的相互作用，利用 R 软件进行富集分析，结果表明这些基因主要参与 HIF-1 信号通路和缺氧反应。因此，本研究采用跑步机训练来模拟肺纤维化小鼠模型，动物实验表明，运动可能影响肺纤维化中铁死亡相关基因的表达，抑制铁死亡，证实了生物信息学分析的可靠性。
研究表明铁的过量积累、基于脂质的细胞内 ROS 的过度积累以及最终的脂质氧化是铁死亡的主要特征，铁沉会对细胞膜造成损伤，导致细胞死亡，细胞死亡通常是由主要在有氧代谢过程中积累的过量 ROS 引起的氧化应激引起的[8-10]。已有抗氧化剂在肺纤维化中应用，其可能是减少肺纤维化期间铁死亡，铁过度积累可以激活 HIF-1 信号通路[11]。这与本研究生物信息学分析一致，本研究富集分析表明 HIF-1 信号通路被激活，诱导肺纤维化后导致铁死亡或细胞凋亡。
此外，本研究通过 PPI 分析获得了由 10 个铁死亡相关基因（CAV1、JUN、NOS2、EPAS1、GDF15、SLC2A1、CDKN2A、CA9、HNF4A、TP63）组成的模块。对这些基因进行随机森林分析，筛选出的前 5 个基因分别为 CAV1、NOS2、GDF15、HNF4A、CDKN2A，筛选出的 5 个与铁死亡相关的基因具有较高的可靠性。
CAV1 是一个膜结合支架蛋白家族，与 CAV2 和 CAV3 蛋白家族相关，CAV1 在肺泡上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等肺组织中广泛表达，许多研究也讨论了 IPF 患者肺组织中 CAV1 表达明显降低[12]，这与本研究生物信息学分析结果一致。原因是正常表达 CAV1 可以抑制转化生长因子（transforming growth factor, TGF）-β 的过表达，CAV1 表达降低会减弱 TGF-β 的抑制作用，从而激活 TGF-β 信号通路，导致细胞外基质大量生成，导致肺纤维化的发生[13]。本研究中的肺纤维化小鼠模型进一步显示了在博来霉素诱导的肺纤维化组织中，CAV1 mRNA 的表达水平明显低于正常对照组；总体生存分析显示，CAV1 高表达患者的生存时间更长。CAV1 是纤维素的主要成分，调节细胞信号传导和内吞作用，过表达 CAV1 可以减少中性粒细胞和单核/巨噬细胞的浸润，防止博来霉素诱导的肺纤维化，这可能与其在炎症活动中的关键调节作用有关[14-15]。本研究动物实验表明，在肺纤维化小鼠中进行跑步机运动时，CAV1 mRNA 的表达增加。相关研究表明，在博来霉素诱导的肺纤维化模型中，跑步机运动可改善肺部和全身炎症[14]，这可能与本研究中跑步机增加 CAV1 有关。
CDKN2A 被称为周期依赖性激酶抑制剂基因，属于周期依赖性激酶抑制剂家族，是重要的肿瘤抑制基因，IPF 患者外周血 CDKN2A mRNA 表达水平较对照组降低，可能与 P53 信号通路激活有关[16]。在本实验中，肺纤维化小鼠肺组织中 CDKN2A mRNA的表达水平低于正常对照组。FERDB 在线工具预测 CDKN2A 与铁死亡相关，并将其归类为铁死亡驱动因子，CDKN2A 是否是 IPF 中铁死亡的驱动因素尚未明确。因此，本研究结果表明 CDKN2A 影响肺纤维化的铁死亡，其机制值得进一步研究。
NOS2 是氧化代谢的关键基因。既往研究报道，在肺纤维化病理生理条件下，存在异常高浓度的一氧化氮，这可能与诱导型一氧化氮合酶活性升高有关，过量的一氧化氮产生可能有助于纤维化的发展[17-18]。GDF15 是一种内分泌激素，是 TGF-β 超家族的成员，可促进肿瘤细胞的铁死亡；GDF15 是一种上皮来源的分泌蛋白，可能是一种有用的上皮应激生物标志物，因为其表达增加与 IPF 患者预后较差相关[19]，这与本研究当前生物信息学分析的结果一致。HNF4A 是一种核转录因子，以同型二聚体的形式与 DNA 结合，主要与肝脏纤维化的发生有关，敲除 HNF4A 可缓解肝纤维化[20]，然而没有关于 HNF4A 与肺纤维化相关性的研究报道。同样，本研究生物信息学分析的动物实验和生存分析表明，HNF4A 与肺纤维化无关联。本研究生物信息学分析数据表明，IPF 组织中 NOS2 和 CAV1 下调，CDKN2A 和 GDF15 上调；但在博来霉素诱导的小鼠 IPF 组织中，NOS2 上调，CDKN2A 下调。实验结果与生物信息学分析结果的不一致可能是由于以下原因：① 用于生物信息学分析的数据来自 IPF 患者，而实验数据来自博来霉素诱导的小鼠，虽然人和小鼠具有很高的基因同源性，但由于物种不同，结果可能存在一定的偏差；② 基因扩增具有很大的时间和空间特异性，从而导致生物信息学分析与实验结果不一致。
本研究有以下局限性：首先，从 IPF 患者肺组织和正常肺组织中获取生物信息学结果，由于实验条件和医院规模的限制，临床组织样本收集不足进行验证。此外，动物模型中不同铁死亡基因表达水平的验证，缺乏枢纽基因在肺纤维化细胞模型中的潜在研究。
综上所述，通过生物信息学分析，本研究确定了 20 个肺纤维化中与铁死亡相关的潜在基因。CAV1、NOS2、GDF15、CDKN2A 可能通过调控铁死亡影响肺纤维化的发生。肺纤维化诱导后的有氧运动训练可减轻肺铁死亡，可能有助于肺纤维化的治疗。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）是一种进行性、慢性、不可逆的肺部疾病，其症状包括肺功能不可逆下降、进行性肺瘢痕形成、间质性肺炎等[1]。既往研究表明，肺纤维化的发生和进展是由于不同刺激下肺泡上皮细胞重复损伤后的异常修复[2]。但其确切的发病机制尚不清楚。近年来，一种铁依赖性、非凋亡调节性的细胞死亡机制被发现并命名为铁死亡，广泛参与卒中、脑损伤和肿瘤的发展，然而，铁是细胞正常生理活动的必需元素，铁死亡与其他形式的细胞死亡（如凋亡、坏死和自噬）不同，是因为脂质活性氧（reactive oxygen species, ROS）的致命铁依赖性积累，其原因是细胞内铁的过度积累导致脂质过氧化升高，从而导致这种类型的细胞死亡[3]。铁死亡相关基因 GPX4 缺陷小鼠表现出更严重的博来霉素诱导的肺纤维化，而转基因小鼠的这种作用减弱，表明铁死亡可能在很大程度上促进了肺纤维化[4]。此外，研究表明，肺内铁负荷过大会导致肺纤维化和肺泡上皮细胞损伤，铁离子螯合剂如去铁胺可降低铁负荷过大引起的肺损伤程度[5]。探究铁死亡参与肺纤维化的机制有助于发现其潜在治疗靶点，因此需进一步的研究来检测铁死亡相关基因，包括与肺纤维化有关的基因。因此，本研究旨在探究肺部感染诱导的铁死亡与肺纤维化的相关性及其机制，为 IFP 的临床诊断和治疗提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 生物信息学数据获取
从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）下载 GSE150910 数据集，该数据集涵盖了 2019 年 1 月—2023 年 12 月 103 个 IPF 肺组织和 103 个正常肺组织的样本信息，患者信息如表1 所示。该数据集来自公共数据库，不需要患者同意和伦理委员会的批准。
表1
GSE150910 数据集中 IPF 及对照患者基本信息
1.2 差异表达基因（differentially expressed gene, DEG）分析
对于 GSE150910 数据集中的 RNA-seq 初始数据，Reads 计数数据采用每百万转录本（transcripts per million, TPM）进行标准化。TPM 标准化公式如下：TPM=读取计数×
1.3 铁死亡相关基因的富集分析
使用 R 3.6.1 软件中的“GO Plot”包进行基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）途径富集分析。GO 分析包括生物过程、细胞成分和分子功能。
1.4 铁死亡相关 DEG 的蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）分析和相关性分析
使用 STRING 在线数据库和 Cytoscape 3.8.1 软件分析与铁死亡相关的 DEG 之间的相互作用，将网络设置为 STRING 在线数据库中的截止点（交互评分>0.15）。节点表示基因，边表示基因之间的相互作用，绿色表示下调基因，蓝色表示上调基因。MCODE 是 Cytoscape 的应用程序，用于基因网络聚类分析，绘制关键模块。利用 R 3.6.1 软件中的“Corrplot”包（Spearman 相关分析函数）识别差异表达的嗜铁相关基因之间的相关性，检验水准 α=0.05。
1.5 随机森林法筛选枢纽基因
通过随机森林算法进一步筛选关键模块中的基因。随机森林算法是解决生物学研究中各种预测问题的一种有效而流行的分类和回归方法。对于重要指标的排序，采用随机森林算法中的平均减少基尼系数来量化哪个指标对分类精度贡献最大。平均减少基尼系数是一个重要的相关指标，因为其较高的量表明，类别衍生杂质的程度可以通过一个变量来最大程度地降低。使用 GSE150910 开发随机森林模型，筛选出的前 5 个枢纽基因用于后续研究和实验验证。
1.6 枢纽基因的动物实验验证
1.6.1 实验动物及分组
从邯郸市中心医院动物实验中心购买 24 只 8 周龄雄性 C57BL/6 小鼠，体重 20～25 g。将小鼠随机分为对照组、运动组、博来霉素组、博来霉素+运动组 4 组，每组 6 只。本研究所有程序经邯郸市中心医院伦理委员会批准［审查批号：2019 第（22）号］，研究内容和过程涉及的动物实验符合实验动物福利的伦理要求，符合《动物保护法》及相关规定。动物实验室设施的环境条件符合中国国家标准《实验动物与环境设施》（GB 14925—2020）[4]，动物饲养管理和动物实验操作符合邯郸市中心医院实验动物管理规定要求。
1.6.2 博来霉素诱导的肺纤维化动物模型
博来霉素组、博来霉素+运动组小鼠在实验程序的第 1 天麻醉下（氯胺酮 100 mg/kg 和噻嗪 10 mg/kg）经气管给药博来霉素（1.5 U/kg），建立博来霉素诱导的肺纤维化模型[5]。
1.6.3 跑步机运动测试和训练
如文献[7]所述，该实验包含跑步机适应、测试和训练，小鼠适应跑步机（15 min/d，25° 倾斜，0.2 kg/h）3 d 后，以 0.2 km/h 的起始速度，每 2.5 分钟增加 0.1 km/h 的速度进行物理测试，实验以疲劳结束（经过 10 次机械刺激，动物也不能运动）。此后，运动组和博来霉素+运动组小鼠被纳入一个为期 4 周、5 次/周、60 min/次的运动训练计划，达到最初身体测试中最高速度的 60%。最后一次训练完成后，将各组小鼠经腹腔内注射氯胺酮/噻嗪（100/10 mg/kg）安乐死，并进行颈椎脱位，收集肺组织用于后续实验。
1.6.4 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR）分析
对小鼠肺组织进行 qRT-PCR 分析，验证铁死亡标志物前列腺素内过氧化物合成酶 2 和枢纽基因，使用 TRIzol 收集每个肺组织样本的总 RNA，收集的 RNA 纯度用 Quantus 荧光仪测定，首先对总 RNA 进行逆转录反应，后将扩增的互补 DNA 样品与一步 SYBR PrimeScript PLUS RTPCR 试剂盒混合。最后，在 AriaMx HRM 系统上进行反应。该反应的阳性对照为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，每个样品采用比较循环阈值法计算。
1.7 枢纽基因的生存分析
从 GEO 数据库下载 GSE70866 数据集，该数据集包含来自 212 例 IPF 患者的基因表达谱数据和生存预后信息，用该数据集来验证枢纽基因的生存预后，用 R 3.6.1 软件对其进行生存分析。
1.8 统计学方法
使用 GraphPad Prism 8.0 和 R 3.6.1 软件进行绘图和统计分析。患者基本信息比较时，计量数据以均数±标准差表示，两组间比较采用 t 检验；计数数据以例数和/或百分数表示，组间比较采用 χ2 检验。测序数据使用 R 3.6.1 软件中的“LIMMA”包进行 DEG 分析，使用“randomForest”包进行枢纽基因筛选。采用单因素方差分析对 4 组小鼠潜在生物标志物的表达量进行统计学分析，并进行 Tukey 多重比较。采用对数秩检验分析不同枢纽基因表达水平的 IPF 患者的生存曲线差异。双侧检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 铁死亡相关 DEG
从 GEO 数据库下载 GSE150910 数据集，得到
表2
IPF 铁死亡相关 DEG
2.2 铁死亡相关 DEG 的富集途径和分析
GO 最显著的富集项包括有机阴离子转运、对缺氧的反应、对氧水平降低的响应（生物过程），基底外侧质膜、细胞皮层、膜筏（细胞成分），DNA-结合转录激活因子活性、RNA 聚合酶Ⅱ特异性、血红素结合、四氟化结合（分子功能），见图1。KEGG 富集分析结果显示，与铁死亡相关的 DEG 主要参与肾细胞癌、花生四烯酸代谢、癌症中心碳代谢、人 T 细胞白血病病毒 1 感染、百日咳、利什曼病、内分泌抵抗、恰加斯病、缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1, HIF-1）信号通路、牛磺酸和次牛磺酸代谢（图2）。
图1
20 个铁死亡相关 DEG 的 GO 富集分析
BP：生物过程；CC：细胞成分；MF：分子功能；DEG：差异表达基因；GO：基因本体论
图2
20 个铁死亡相关 DEG 的 KEGG 富集分析
DEG：差异表达基因；KEGG：京都基因和基因组数据库；FC：差异倍数；HIF-1：缺氧诱导因子-1
2.3 铁死亡相关 DEG 的 PPI 网络和相关性分析
PPI 网络分析显示铁死亡相关 DEG 之间存在相互作用（图3a）。图3b 显示了每个基因的相互作用数量。采用 Spearman 相关分析研究这些基因表达的相关性。来自 GSE150910 数据集的研究结果表明，20 个差异表达的铁死亡相关基因之间存在相互作用（图3c）。此外，利用 Cytoscape 的应用程序 MCODE 对基因网络进行聚类分析。结果，通过绘制关键模块，建立了 4 个切割基因（CAV1、JUN、NOS2、EPAS1）和 6 个凸起基因（GDF15、SLC2A1、CDKN2A、CA9、HNF4A、TP63）（图3d）。
图3
20 个铁死亡相关 DEG 的 PPI 网络分析和相关性分析
a. 20 个铁死亡相关 DEG 中的 PPI 网络；b. 各 DEG 的相互作用数；c. 20 个铁死亡相关 DEG 的 Spearman 相关性分析；d. 关键模块由 MCODE 鉴定，用于识别网络基因聚类。DEG：差异表达基因；PPI：蛋白质相互作用；绿色代表下调基因，蓝色代表上调基因
2.4 使用随机森林分类器识别关键 DEG
使用随机森林算法对 MCODE 筛选的 10 个基因进行排名，并选择前 5 个 DEG（CAV1、NOS2、GDF15、HNF4A、CDKN2A）进行进一步的分析和验证动物实验（图4）。
图4
使用随机森林分类器鉴定最重要的枢纽基因
2.5 qRT-PCR 检测潜在的生物标志物表达
筛选的肺纤维化小鼠模型生物标志物（CAV1、NOS2、GDF15、HNF4A、CDKN2A）和铁沉标志物 PDGS2 进行 qRT-PCR 验证。4 组间 HNF4A 的表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。运动训练后，与博来霉素组相比，博来霉素+运动组 CAV1、CDKN2A 表达升高，PTGS2、GDF15、NOS2 表达降低（图5）。
图5
qRT-PCR 检测潜在的生物标志物表达
qRT-PCR 检测肺纤维化小鼠模型生物标志物（
2.6 验证组中枢纽基因的生存分析
NOS2 和 GDF15 基因表达水平较高的 IPF 患者的总生存率低于这 2 个基因表达水平较低的患者（P<0.05）。此外，与高表达水平的患者相比，IPF 患者中 CAV1 和 CDKN2A 的低表达水平与较差的总生存率相关（P<0.05）。HNF4A 表达水平与 IPF 患者总生存率无关（P>0.05）。见图6。
图6
验证组 IPF 患者枢纽基因表达水平与总生存时间的 Kaplan-Meier 生存分析
a.
3 讨论
本研究确定了 IPF 中铁死亡的关键相关基因，并探讨了 IPF 中铁死亡的潜在发病机制。本研究从 GSE150910 和 FerrDb 数据集的交叉集中共获得了 20 个基因，包括 13 个上调基因和 7 个下调基因，它们之间存在显著的相互作用，利用 R 软件进行富集分析，结果表明这些基因主要参与 HIF-1 信号通路和缺氧反应。因此，本研究采用跑步机训练来模拟肺纤维化小鼠模型，动物实验表明，运动可能影响肺纤维化中铁死亡相关基因的表达，抑制铁死亡，证实了生物信息学分析的可靠性。
研究表明铁的过量积累、基于脂质的细胞内 ROS 的过度积累以及最终的脂质氧化是铁死亡的主要特征，铁沉会对细胞膜造成损伤，导致细胞死亡，细胞死亡通常是由主要在有氧代谢过程中积累的过量 ROS 引起的氧化应激引起的[8-10]。已有抗氧化剂在肺纤维化中应用，其可能是减少肺纤维化期间铁死亡，铁过度积累可以激活 HIF-1 信号通路[11]。这与本研究生物信息学分析一致，本研究富集分析表明 HIF-1 信号通路被激活，诱导肺纤维化后导致铁死亡或细胞凋亡。
此外，本研究通过 PPI 分析获得了由 10 个铁死亡相关基因（CAV1、JUN、NOS2、EPAS1、GDF15、SLC2A1、CDKN2A、CA9、HNF4A、TP63）组成的模块。对这些基因进行随机森林分析，筛选出的前 5 个基因分别为 CAV1、NOS2、GDF15、HNF4A、CDKN2A，筛选出的 5 个与铁死亡相关的基因具有较高的可靠性。
CAV1 是一个膜结合支架蛋白家族，与 CAV2 和 CAV3 蛋白家族相关，CAV1 在肺泡上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等肺组织中广泛表达，许多研究也讨论了 IPF 患者肺组织中 CAV1 表达明显降低[12]，这与本研究生物信息学分析结果一致。原因是正常表达 CAV1 可以抑制转化生长因子（transforming growth factor, TGF）-β 的过表达，CAV1 表达降低会减弱 TGF-β 的抑制作用，从而激活 TGF-β 信号通路，导致细胞外基质大量生成，导致肺纤维化的发生[13]。本研究中的肺纤维化小鼠模型进一步显示了在博来霉素诱导的肺纤维化组织中，CAV1 mRNA 的表达水平明显低于正常对照组；总体生存分析显示，CAV1 高表达患者的生存时间更长。CAV1 是纤维素的主要成分，调节细胞信号传导和内吞作用，过表达 CAV1 可以减少中性粒细胞和单核/巨噬细胞的浸润，防止博来霉素诱导的肺纤维化，这可能与其在炎症活动中的关键调节作用有关[14-15]。本研究动物实验表明，在肺纤维化小鼠中进行跑步机运动时，CAV1 mRNA 的表达增加。相关研究表明，在博来霉素诱导的肺纤维化模型中，跑步机运动可改善肺部和全身炎症[14]，这可能与本研究中跑步机增加 CAV1 有关。
CDKN2A 被称为周期依赖性激酶抑制剂基因，属于周期依赖性激酶抑制剂家族，是重要的肿瘤抑制基因，IPF 患者外周血 CDKN2A mRNA 表达水平较对照组降低，可能与 P53 信号通路激活有关[16]。在本实验中，肺纤维化小鼠肺组织中 CDKN2A mRNA的表达水平低于正常对照组。FERDB 在线工具预测 CDKN2A 与铁死亡相关，并将其归类为铁死亡驱动因子，CDKN2A 是否是 IPF 中铁死亡的驱动因素尚未明确。因此，本研究结果表明 CDKN2A 影响肺纤维化的铁死亡，其机制值得进一步研究。
NOS2 是氧化代谢的关键基因。既往研究报道，在肺纤维化病理生理条件下，存在异常高浓度的一氧化氮，这可能与诱导型一氧化氮合酶活性升高有关，过量的一氧化氮产生可能有助于纤维化的发展[17-18]。GDF15 是一种内分泌激素，是 TGF-β 超家族的成员，可促进肿瘤细胞的铁死亡；GDF15 是一种上皮来源的分泌蛋白，可能是一种有用的上皮应激生物标志物，因为其表达增加与 IPF 患者预后较差相关[19]，这与本研究当前生物信息学分析的结果一致。HNF4A 是一种核转录因子，以同型二聚体的形式与 DNA 结合，主要与肝脏纤维化的发生有关，敲除 HNF4A 可缓解肝纤维化[20]，然而没有关于 HNF4A 与肺纤维化相关性的研究报道。同样，本研究生物信息学分析的动物实验和生存分析表明，HNF4A 与肺纤维化无关联。本研究生物信息学分析数据表明，IPF 组织中 NOS2 和 CAV1 下调，CDKN2A 和 GDF15 上调；但在博来霉素诱导的小鼠 IPF 组织中，NOS2 上调，CDKN2A 下调。实验结果与生物信息学分析结果的不一致可能是由于以下原因：① 用于生物信息学分析的数据来自 IPF 患者，而实验数据来自博来霉素诱导的小鼠，虽然人和小鼠具有很高的基因同源性，但由于物种不同，结果可能存在一定的偏差；② 基因扩增具有很大的时间和空间特异性，从而导致生物信息学分析与实验结果不一致。
本研究有以下局限性：首先，从 IPF 患者肺组织和正常肺组织中获取生物信息学结果，由于实验条件和医院规模的限制，临床组织样本收集不足进行验证。此外，动物模型中不同铁死亡基因表达水平的验证，缺乏枢纽基因在肺纤维化细胞模型中的潜在研究。
综上所述，通过生物信息学分析，本研究确定了 20 个肺纤维化中与铁死亡相关的潜在基因。CAV1、NOS2、GDF15、CDKN2A 可能通过调控铁死亡影响肺纤维化的发生。肺纤维化诱导后的有氧运动训练可减轻肺铁死亡，可能有助于肺纤维化的治疗。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
