引用本文： 曾义军, 余水, 雷町, 张恒, 李劲梅, 周章明. 谷氨酸受体 5 在人难治性颞叶癫痫脑组织中的表达研究. 华西医学, 2017, 32(5): 659-664. doi: 10.7507/1002-0179.201604129 复制
药物难治性癫痫是指经过 3 种及以上一线抗癫痫药物正规治疗 2 年以上，发作频率>2 次/月的原发性癫痫。药物难治性癫痫占癫痫患者的 20%～40%，其中以颞叶癫痫最为常见[1]。长期以来，人们一直在探索颞叶癫痫的病因、病变特点及其发病机制，并努力寻找治疗的有效措施。近年在癫痫发病机制相关神经递质受体的研究中，从属于谷氨酸受体（glutamic receptor，GLUR）的红藻氨酸受体（kainate receptors，KAR）家族越来越受到关注，红藻氨酸（kainate，KA）是从一种海藻中天然提取的兴奋性氨基酸——谷氨酸的结构类似物，通过 KA 诱导的癫痫动物模型中发现，KA 在颞叶癫痫中诱导痫样发作和产生神经病理性损害，表明 KA 是一种强效的神经毒素[2-3]。KA 诱导的癫痫模型的特点是具有典型的颞叶癫痫的共同特征：对大部分抗癫痫药物耐药；与人类颞叶癫痫有相似的癫痫发作行为特点；神经病理学上特异的海马损伤与颞叶癫痫的海马硬化有关[3]。分子克隆发现 KA 与离子型 GLUR 存在高亲和性[4-5]。在 KA 诱导的颞叶癫痫模型中很早就发现 KAR 是 GLUR 中的一个独立受体家族[6]。通过 KAR 亚基克隆明确发现 KAR 家族由 5 种受体亚基组成，包括 GLUR5、GLUR6、GLUR7、KA1 和 KA2；KAR 在中枢神经系统中广泛分布，皮质的椎体细胞树突棘的突触后密度是主要分布部位，而胶质细胞少见分布[7]。目前对难治性颞叶癫痫发病机制的研究主要来源于啮齿类鼠模型或体外细胞实验，但是对人药物难治性癫痫研究甚少。因此，本研究通过测定 GLUR5 在人难治性颞叶癫痫和马桑内酯诱导的恒河猴癫痫模型脑组织（海马和颞叶）中的蛋白表达水平，探讨 GLUR5 与人难治性癫痫的发病关系，为癫痫的病因学研究和临床治疗提供可能的理论依据。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 临床资料部分 本研究经过我院伦理委员会批准。选取 2007 年 1 月—2015 年 12 月在四川大学华西医院行手术治疗的 54 例药物难治性颞叶癫痫患者作为临床病例组。纳入标准：① 年龄≥14 岁；② 有复杂部分性发作或复杂部分性发作继发全身性发作的颞叶癫痫典型临床表现和脑电图特征，经正规服用 3 种或 3 种以上一线抗癫痫药物有效剂量治疗 2 年以上，发作频率>2 次/月；③ 患者术前经视频脑电图或术前放置硬膜下皮质电极监测，并结合 CT 或 MRI（MRS）定位致痫灶；④ 患者严格进行术前评估，确定适合手术后并于术中用皮质电极监测；⑤ 患者及其家属术前签署知情同意书。54 例患者中，男 34 例，女 20 例；年龄 15～45 岁，平均（23.87±6.32）岁；病程 2～24 年，平均（9.93±6.95）年；术前癫痫发作频数为 4～58 次/月，平均（15.25±14.40）次/月；癫痫发作类型为复杂部分性发作或继发全身性发作；抗癫痫药物使用：3 种 41 例，3 种以上 13 例；MRI 或 CT 检查：海马硬化 33 例，颞叶内侧占位病变 9 例，正常 12 例；视频脑电图检查：痫波发放 54 例；手术切除部位：海马 31 例，颞叶+海马 23 例；病理检查：异常改变 52 例，正常 2 例。
选取 2007 年 1 月—2015 年 12 月在四川大学华西医院收治的 43 例因外伤、肿瘤或大面积脑出血并发脑疝行去颞叶皮质减压手术的患者作为临床对照组。纳入标准：① 年龄≥14 岁；② 无癫痫发作史；③ 病理切片证实脑组织结构基本正常；④ 取材部位为颞叶或海马；⑤ 患者家属同意，并签署知情同意书。43 例患者中，男 28 例，女 15 例；年龄 19～57 岁，平均（37.75±12.56）岁；病因：脑外伤 27 例，胶质细胞瘤 5 例，大面积脑出血并脑疝 11 例；手术切除部位：颞叶 27 例，海马 16 例；病理检查：异常改变 3 例，正常 40 例。
1.1.2 动物实验部分 选取 6 只健康成年恒河猴，均为雄性，平均年龄 35.5 个月，体质量 5.1～6.2 kg，由四川大学实验动物中心提供。用随机数字表法将恒河猴分为动物实验组和动物对照组，每组各 3 只。
1.2 研究方法
1.2.1 动物癫痫模型的建立 对动物实验组恒河猴采用肌肉注射马桑内酯（5 mg/mL，成都中医药大学提取），按 0.6 mL/kg 肌肉注射，每 72 小时注射 1 次，每天观察恒河猴情况，并根据恒河猴每次对马桑内酯的反应调整用药，以达到痫样发作的最小剂量为准，造模成功的动物实验组恒河猴均有自发性癫痫发作，且符合颞叶癫痫的表现。头皮电极和深部电极显示痫波来自颞区和海马。动物对照组给予相应剂量的生理盐水肌肉注射。动物实验组和动物对照组的饲养时间均为 90 d。若发生癫痫持续状态则给予地西泮 1 mg/kg 肌肉注射以终止癫痫发作，降低其死亡率。动物实验组 3 只恒河猴均未发生癫痫持续状态，均成活。
1.2.2 样本收集 ① 临床患者标本：术中获取标本后立即放入已编号并用焦炭酸二乙酯液浸泡 24 h 以上的细胞冻存管，置于液氮中冷冻保存。同时切取细条状颞叶皮质组织和海马组织放入丙二酮中固定。② 动物实验标本：两组恒河猴均给予氯胺酮深度麻醉后开颅切取其海马及颞叶组织，其他处理同临床患者标本。
1.2.3 荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） ① RNA 制备及质量检测：细胞总信使 RNA（messenger RNA，mRNA）采用 Unlzol 试剂盒，提取的总 RNA 沉淀在加入了无 RNA 酶的 Mikki-Q 水完全溶解后，–80℃ 冰箱保存。② 荧光定量 PCR：紫外分光光度仪、电泳实验进行质量检测。检测合格后采用 mRNA 柱纯化试剂盒（Boistar 公司）纯化个体样品的mRNA，逆转录生成互补 DNA。分别取 5 μg mRNA 为逆转录模板。
根据荧光定量逆转录 PCR 引物设计原则，采用 Primer Express 1.5 软件（美国 Invitrogen 公司）设计引物：GLUR5 上游引物为 5’-GAAGACAGCACAGGTCTAAT-3’，下游引物为 5’-CAATCAAATATCACATAGAACT- 3’，Taqman 探针为 5’-CTCATCAAAGCTCCCTCCAGA-3’。Beta-actin 为内参基因，上游引物为 5’-tgggtgtgaa ccacgagaa-3’，下游引物为 5’-ggcatggactgtggtcatga-3’，Taqman 探针为5’-ctgcaccaccaactgcttagc-3’。
反应体系置于 FTC2000 PCR 仪（加拿大 Funglyn 公司）进行 PCR。样品按下列条件扩增：94℃ 2 min；94℃ 20 s；55℃ 30 s；60℃ 40 s，45 个循环，每个样品重复检测 3 次。PCR 反应产物任取 2 个样本 1.5% 琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段。测定各个样品的循环阈值（cycle threshold，CT），即每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。使用 Rest 软件进行 CT 值的相对定量分析，并计算各样品中 GLUR5 的 mRNA 表达比值（expression ratios），即R 值[8]。
1.2.4 蛋白质印迹实验 各组的每个脑组织样本均称取 100 mg，匀浆后离心，取少量上清液行二辛可宁酸蛋白定量，调整浓度为 2 μg/μL。第 1 泳道 maker 上样 10 μL，其余泳道上样 30 μL。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，恒定电压 160 V 进行电泳。电转移至聚偏氟乙烯膜（美国 Dupont 公司），300 V、300 mA 恒压转移 1 h。聚偏氟乙烯膜用磷酸盐缓冲液洗涤后入含 3% 牛血清白蛋白的 pH 值 7.2 的磷酸盐缓冲液封闭 1 h。
加入一抗兔抗人 GLUR5 抗体（#22053，美国 MilliPORE 公司，）4℃ 过夜，一抗稀释比例为 1∶1 000。选择辣根过氧化物标记的二抗 PIERCE，1∶1 000 稀释，室温下反应 1 h。辣根过氧化物-电化学发光法将 X 线片曝光，显影，定影。图像分析采用 LabworksTM 扫描分析软件计算灰度值。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 13.0 软件行统计分析。计量数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析及t 检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 临床病例与对照结果
2.1.1 荧光定量 PCR 结果 临床病例组与临床对照组颞叶组织的 GLUR5 mRNA 表达的R 值为 0.262，差异无统计学意义（P>0.05）；海马组织的 GLUR5 mRNA 表达R 值为 4.896，差异有统计学意义（P<0.05）。GLUR5 扩增曲线显示临床病例组较临床对照组海马组织中 GLUR5 mRNA 水平向上调节；扩增曲线显示临床病例组与临床对照组颞叶组织中 GLUR5 mRNA 水平无明显变化。GLUR5 PCR 扩增产物电泳图显示扩增片段为 161 bp。见图 1～3。
图1
临床病例组与临床对照组海马组织的 GLUR5 扩增曲线图
C：临床对照组；E：临床病例组
图2
临床病例组与临床对照组颞叶组织的 GLUR5 扩增曲线图
C：临床对照组；E：临床病例组
图3
GLUR5 PCR 扩增产物电泳图
a. 难治性颞叶癫痫患者海马组织扩增产物电泳图；b. actin 扩增片段；M 为 maker；1、2 为任选样
2.1.2 蛋白质印迹实验结果 GLUR5/actin 灰度值：临床病例组颞叶组织为 2.172±0.063，临床对照组为 2.142±0.060，差异无统计学意义（P>0.05）；临床病例组海马组织为 2.548±0.509，临床对照组为 1.584±0.415，差异有统计学意义（P<0.05）。目的蛋白条带结果显示 GLUR5 蛋白表达临床病例组颞叶组织与临床对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）；而在海马组织中的表达明显高于临床对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
两组患者颞叶、海马组织中 GLUR5 的蛋白表达
a. 颞叶组织，1～3 为临床病例组，4～6 为临床对照组；b. 海马组织，1～4 为临床病例组，5～7 为临床对照组
2.2 动物实验结果
蛋白质印迹实验结果：动物实验组海马组织 GLUR5/actin 灰度值为 1.007±0.034，动物对照组为 1.001±0.032，差异无统计学意义（P>0.05）。动物实验组颞叶组织 GLUR5/actin 灰度值为 0.763±0.026，动物对照组为 0.742±0.034，差异无统计学意义（P>0.05）。目的蛋白条带结果显示 GLUR5 蛋白表达动物实验组海马及颞叶组织与动物对照组差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 5。
图5
两组动物海马、颞叶组织中 GLUR5 的蛋白表达
a. 海马组织；b. 颞叶组织；1～3 为动物实验组，4～6 为动物对照组
3 讨论
3.1 GLUR5 在难治性颞叶癫痫中的作用
国外研究发现 KAR 在癫痫发病中的主要功能是促进兴奋性突触传递，影响 γ-氨基丁酸（gamma aminobutyric acid，GABA）能中间神经元的活性，整合突触内电流，突触重组，参与诱导兴奋性中毒作用[9-10]。GLUR5 是 KAR 中主要的也是研究最广泛的亚基，在突触传递和突触重组中有重要作用[11]。动物实验发现托吡酯（商品名：妥泰）不仅可选择性阻滞大鼠背外侧的杏仁核神经元的 GLUR5 受体而降低兴奋性突触后电流波幅，也能提高 GLUR5 的激动剂三磷酸腺苷酶所诱发的阵挛性癫痫的阈值[12]。Smolders 等[13]在动物实验和体外实验均证实 GLUR5 特异性受体抑制剂 Y33337 可以阻止癫痫活动，他们认为这种作用可能是通过阻滞谷氨酸介导的神经兴奋作用，增加 GABA 介导的抑制作用实现的。这些研究均支持 GLUR5 受体是癫痫活动的关键兴奋性环节的假说。GLUR5 对突触内电流的影响及其在突触传递中的具体作用机制尚需进一步深入研究。
3.2 GLUR5 在难治性颞叶癫痫患者海马及颞叶中的表达
Mathern 等[14]曾用原位杂交的方法探讨颞叶癫痫患者术后海马组织中 GLUR5-7 的 mRNA 表达水平，但该研究的主要缺点是使用尸体解剖后的海马组织作为对照组，很可能因海马组织难以耐受缺氧而导致 mRNA 总体水平下降，因而其研究结果可信度不高，该研究也未检测 KAR 的蛋白质表达水平。GLUR5 在人类难治性颞叶癫痫中是否被激活并不清楚，国内外少有临床研究涉及。因此，我们检测难治性颞叶癫痫患者颞叶皮质和海马组织中 GLUR5 的 mRNA 和蛋白质水平，了解 GLUR5 在人难治性颞叶癫痫脑组织中的表达情况，探讨其与难治性颞叶癫痫的关系。我们的研究在符合人体试验伦理要求的前提下采用活体组织作为对照，通过荧光定量 PCR 和蛋白质印迹法检测难治性颞叶癫痫患者术后颞叶组织和海马组织，结果发现 GLUR5 的 mRNA 水平和蛋白质表达水平在海马组织中异常升高，而颞叶皮质中 GLUR5 的表达水平与对照组相比差异无统计学意义，与 DeFelipe 等[15]的研究结果一致，提示尽管颞叶皮质也是难治性颞叶癫痫的病灶部位，但 GLUR5 的主要作用部位不在颞叶皮质，而是在颞叶癫痫的核心病变部位海马。海马一直是研究 GLUR5 的优势部位，我们的研究结果进一步证实 GLUR5 在人难治性颞叶癫痫中仍然是通过作用于海马参与难治性颞叶癫痫疾病发生机制。
3.3 GLUR5 在马桑内酯诱导的恒河猴癫痫模型中的表达
GLUR5 的异常表达是否也存在于非难治性癫痫并不清楚，在无法得到非难治性癫痫患者标本的情况下，我们选择在种属上与人类更接近，病理检查证实海马有病理改变，皮质电极也证实痫波来自颞叶海马的马桑内酯诱导的恒河猴癫痫模型作为研究对象，经过 3 个月反复诱导癫痫发作后处死，在其海马中进一步检测 GLUR5 和 GLUR6 蛋白质水平，结果发现恒河猴癫痫模型的海马中 GLUR5 蛋白质水平与对照组的差异无统计学意义。这一研究结果可能提示并非所有来源于颞叶的癫痫活动都与 GLUR 作用有关。我们的研究结果与 KA 诱导的癫痫大鼠模型实验结果存在差异。Ullal 等[16]研究发现在 KA 刺激后 72 h 和 180 d 后的大鼠海马中的 GLUR5 均持续升高。经马桑内酯诱导的癫痫模型致痫机制可能通过激活 L2 型钙离子通道和 N2 甲基 2D2 天冬氨酸受体介导的钙离子通道引起神经细胞内钙离子浓度升高抑制 GABA 功能，而引起癫痫发作[17]。在我们的研究中马桑内酯癫痫模型诱导过程仅 3 个月，目的在于建立非难治性癫痫模型；并且在恒河猴癫痫模型海马的病理结果中仅发现神经元的变性，而神经纤维染色并未发现苔藓纤维轴突出芽现象。而在难治性颞叶癫痫患者海马中观察到神经元丢失、坏死，苔藓纤维出芽现象。因此马桑内酯诱导的恒河猴癫痫模型海马中的 GLUR5 蛋白质水平与对照组比较差异无统计学意义，可能支持 GLUR5 的异常表达主要参与难治性癫痫的发生，也或许与种属差异或诱导剂有关。而 GLUR5 是否也参与其他慢性非难治性癫痫的发生，需进一步研究来证实。
与癫痫相关的 KAR 受体研究已经进入了分子水平，但仍有很多需要进一步探索的领域。如探讨研究 KAR 与难治性颞叶癫痫发生的因果关系，是因为 KAR 的表达异常导致癫痫的发生，还是因为癫痫发生后引起 KAR 的异常表达增高，导致难治性癫痫发生还不清楚。其次，GLUR5 在难治性癫痫患者中高表达说明其可能参与人难治性癫痫的发病机制，托吡酯是目前唯一可以阻滞 GLUR5 受体的抗癫痫药物，但是研究发现 GLUR5 拮抗剂对预防和阻止边缘叶所致的癫痫发作无明显效果。托吡酯具有阻滞钠离子通道，增加 GABA 介导的抑制作用和阻滞谷氨酸介导的神经兴奋作用，影响氯离子膜运转及钙离子通道阻滞的多重作用机制，其可能不只是通过选择性作用于 GLUR5 受体而发挥抗癫痫的药物作用。应进一步明确 GLUR5 与人难治性颞叶癫痫中的致病关系及其在难治性颞叶癫痫中的病理机制，为研发新的抗癫痫药物提供可能的理论依据。
药物难治性癫痫是指经过 3 种及以上一线抗癫痫药物正规治疗 2 年以上，发作频率>2 次/月的原发性癫痫。药物难治性癫痫占癫痫患者的 20%～40%，其中以颞叶癫痫最为常见[1]。长期以来，人们一直在探索颞叶癫痫的病因、病变特点及其发病机制，并努力寻找治疗的有效措施。近年在癫痫发病机制相关神经递质受体的研究中，从属于谷氨酸受体（glutamic receptor，GLUR）的红藻氨酸受体（kainate receptors，KAR）家族越来越受到关注，红藻氨酸（kainate，KA）是从一种海藻中天然提取的兴奋性氨基酸——谷氨酸的结构类似物，通过 KA 诱导的癫痫动物模型中发现，KA 在颞叶癫痫中诱导痫样发作和产生神经病理性损害，表明 KA 是一种强效的神经毒素[2-3]。KA 诱导的癫痫模型的特点是具有典型的颞叶癫痫的共同特征：对大部分抗癫痫药物耐药；与人类颞叶癫痫有相似的癫痫发作行为特点；神经病理学上特异的海马损伤与颞叶癫痫的海马硬化有关[3]。分子克隆发现 KA 与离子型 GLUR 存在高亲和性[4-5]。在 KA 诱导的颞叶癫痫模型中很早就发现 KAR 是 GLUR 中的一个独立受体家族[6]。通过 KAR 亚基克隆明确发现 KAR 家族由 5 种受体亚基组成，包括 GLUR5、GLUR6、GLUR7、KA1 和 KA2；KAR 在中枢神经系统中广泛分布，皮质的椎体细胞树突棘的突触后密度是主要分布部位，而胶质细胞少见分布[7]。目前对难治性颞叶癫痫发病机制的研究主要来源于啮齿类鼠模型或体外细胞实验，但是对人药物难治性癫痫研究甚少。因此，本研究通过测定 GLUR5 在人难治性颞叶癫痫和马桑内酯诱导的恒河猴癫痫模型脑组织（海马和颞叶）中的蛋白表达水平，探讨 GLUR5 与人难治性癫痫的发病关系，为癫痫的病因学研究和临床治疗提供可能的理论依据。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 临床资料部分 本研究经过我院伦理委员会批准。选取 2007 年 1 月—2015 年 12 月在四川大学华西医院行手术治疗的 54 例药物难治性颞叶癫痫患者作为临床病例组。纳入标准：① 年龄≥14 岁；② 有复杂部分性发作或复杂部分性发作继发全身性发作的颞叶癫痫典型临床表现和脑电图特征，经正规服用 3 种或 3 种以上一线抗癫痫药物有效剂量治疗 2 年以上，发作频率>2 次/月；③ 患者术前经视频脑电图或术前放置硬膜下皮质电极监测，并结合 CT 或 MRI（MRS）定位致痫灶；④ 患者严格进行术前评估，确定适合手术后并于术中用皮质电极监测；⑤ 患者及其家属术前签署知情同意书。54 例患者中，男 34 例，女 20 例；年龄 15～45 岁，平均（23.87±6.32）岁；病程 2～24 年，平均（9.93±6.95）年；术前癫痫发作频数为 4～58 次/月，平均（15.25±14.40）次/月；癫痫发作类型为复杂部分性发作或继发全身性发作；抗癫痫药物使用：3 种 41 例，3 种以上 13 例；MRI 或 CT 检查：海马硬化 33 例，颞叶内侧占位病变 9 例，正常 12 例；视频脑电图检查：痫波发放 54 例；手术切除部位：海马 31 例，颞叶+海马 23 例；病理检查：异常改变 52 例，正常 2 例。
选取 2007 年 1 月—2015 年 12 月在四川大学华西医院收治的 43 例因外伤、肿瘤或大面积脑出血并发脑疝行去颞叶皮质减压手术的患者作为临床对照组。纳入标准：① 年龄≥14 岁；② 无癫痫发作史；③ 病理切片证实脑组织结构基本正常；④ 取材部位为颞叶或海马；⑤ 患者家属同意，并签署知情同意书。43 例患者中，男 28 例，女 15 例；年龄 19～57 岁，平均（37.75±12.56）岁；病因：脑外伤 27 例，胶质细胞瘤 5 例，大面积脑出血并脑疝 11 例；手术切除部位：颞叶 27 例，海马 16 例；病理检查：异常改变 3 例，正常 40 例。
1.1.2 动物实验部分 选取 6 只健康成年恒河猴，均为雄性，平均年龄 35.5 个月，体质量 5.1～6.2 kg，由四川大学实验动物中心提供。用随机数字表法将恒河猴分为动物实验组和动物对照组，每组各 3 只。
1.2 研究方法
1.2.1 动物癫痫模型的建立 对动物实验组恒河猴采用肌肉注射马桑内酯（5 mg/mL，成都中医药大学提取），按 0.6 mL/kg 肌肉注射，每 72 小时注射 1 次，每天观察恒河猴情况，并根据恒河猴每次对马桑内酯的反应调整用药，以达到痫样发作的最小剂量为准，造模成功的动物实验组恒河猴均有自发性癫痫发作，且符合颞叶癫痫的表现。头皮电极和深部电极显示痫波来自颞区和海马。动物对照组给予相应剂量的生理盐水肌肉注射。动物实验组和动物对照组的饲养时间均为 90 d。若发生癫痫持续状态则给予地西泮 1 mg/kg 肌肉注射以终止癫痫发作，降低其死亡率。动物实验组 3 只恒河猴均未发生癫痫持续状态，均成活。
1.2.2 样本收集 ① 临床患者标本：术中获取标本后立即放入已编号并用焦炭酸二乙酯液浸泡 24 h 以上的细胞冻存管，置于液氮中冷冻保存。同时切取细条状颞叶皮质组织和海马组织放入丙二酮中固定。② 动物实验标本：两组恒河猴均给予氯胺酮深度麻醉后开颅切取其海马及颞叶组织，其他处理同临床患者标本。
1.2.3 荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） ① RNA 制备及质量检测：细胞总信使 RNA（messenger RNA，mRNA）采用 Unlzol 试剂盒，提取的总 RNA 沉淀在加入了无 RNA 酶的 Mikki-Q 水完全溶解后，–80℃ 冰箱保存。② 荧光定量 PCR：紫外分光光度仪、电泳实验进行质量检测。检测合格后采用 mRNA 柱纯化试剂盒（Boistar 公司）纯化个体样品的mRNA，逆转录生成互补 DNA。分别取 5 μg mRNA 为逆转录模板。
根据荧光定量逆转录 PCR 引物设计原则，采用 Primer Express 1.5 软件（美国 Invitrogen 公司）设计引物：GLUR5 上游引物为 5’-GAAGACAGCACAGGTCTAAT-3’，下游引物为 5’-CAATCAAATATCACATAGAACT- 3’，Taqman 探针为 5’-CTCATCAAAGCTCCCTCCAGA-3’。Beta-actin 为内参基因，上游引物为 5’-tgggtgtgaa ccacgagaa-3’，下游引物为 5’-ggcatggactgtggtcatga-3’，Taqman 探针为5’-ctgcaccaccaactgcttagc-3’。
反应体系置于 FTC2000 PCR 仪（加拿大 Funglyn 公司）进行 PCR。样品按下列条件扩增：94℃ 2 min；94℃ 20 s；55℃ 30 s；60℃ 40 s，45 个循环，每个样品重复检测 3 次。PCR 反应产物任取 2 个样本 1.5% 琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段。测定各个样品的循环阈值（cycle threshold，CT），即每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。使用 Rest 软件进行 CT 值的相对定量分析，并计算各样品中 GLUR5 的 mRNA 表达比值（expression ratios），即R 值[8]。
1.2.4 蛋白质印迹实验 各组的每个脑组织样本均称取 100 mg，匀浆后离心，取少量上清液行二辛可宁酸蛋白定量，调整浓度为 2 μg/μL。第 1 泳道 maker 上样 10 μL，其余泳道上样 30 μL。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，恒定电压 160 V 进行电泳。电转移至聚偏氟乙烯膜（美国 Dupont 公司），300 V、300 mA 恒压转移 1 h。聚偏氟乙烯膜用磷酸盐缓冲液洗涤后入含 3% 牛血清白蛋白的 pH 值 7.2 的磷酸盐缓冲液封闭 1 h。
加入一抗兔抗人 GLUR5 抗体（#22053，美国 MilliPORE 公司，）4℃ 过夜，一抗稀释比例为 1∶1 000。选择辣根过氧化物标记的二抗 PIERCE，1∶1 000 稀释，室温下反应 1 h。辣根过氧化物-电化学发光法将 X 线片曝光，显影，定影。图像分析采用 LabworksTM 扫描分析软件计算灰度值。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 13.0 软件行统计分析。计量数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析及t 检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 临床病例与对照结果
2.1.1 荧光定量 PCR 结果 临床病例组与临床对照组颞叶组织的 GLUR5 mRNA 表达的R 值为 0.262，差异无统计学意义（P>0.05）；海马组织的 GLUR5 mRNA 表达R 值为 4.896，差异有统计学意义（P<0.05）。GLUR5 扩增曲线显示临床病例组较临床对照组海马组织中 GLUR5 mRNA 水平向上调节；扩增曲线显示临床病例组与临床对照组颞叶组织中 GLUR5 mRNA 水平无明显变化。GLUR5 PCR 扩增产物电泳图显示扩增片段为 161 bp。见图 1～3。
图1
临床病例组与临床对照组海马组织的 GLUR5 扩增曲线图
C：临床对照组；E：临床病例组
图2
临床病例组与临床对照组颞叶组织的 GLUR5 扩增曲线图
C：临床对照组；E：临床病例组
图3
GLUR5 PCR 扩增产物电泳图
a. 难治性颞叶癫痫患者海马组织扩增产物电泳图；b. actin 扩增片段；M 为 maker；1、2 为任选样
2.1.2 蛋白质印迹实验结果 GLUR5/actin 灰度值：临床病例组颞叶组织为 2.172±0.063，临床对照组为 2.142±0.060，差异无统计学意义（P>0.05）；临床病例组海马组织为 2.548±0.509，临床对照组为 1.584±0.415，差异有统计学意义（P<0.05）。目的蛋白条带结果显示 GLUR5 蛋白表达临床病例组颞叶组织与临床对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）；而在海马组织中的表达明显高于临床对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
两组患者颞叶、海马组织中 GLUR5 的蛋白表达
a. 颞叶组织，1～3 为临床病例组，4～6 为临床对照组；b. 海马组织，1～4 为临床病例组，5～7 为临床对照组
2.2 动物实验结果
蛋白质印迹实验结果：动物实验组海马组织 GLUR5/actin 灰度值为 1.007±0.034，动物对照组为 1.001±0.032，差异无统计学意义（P>0.05）。动物实验组颞叶组织 GLUR5/actin 灰度值为 0.763±0.026，动物对照组为 0.742±0.034，差异无统计学意义（P>0.05）。目的蛋白条带结果显示 GLUR5 蛋白表达动物实验组海马及颞叶组织与动物对照组差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 5。
图5
两组动物海马、颞叶组织中 GLUR5 的蛋白表达
a. 海马组织；b. 颞叶组织；1～3 为动物实验组，4～6 为动物对照组
3 讨论
3.1 GLUR5 在难治性颞叶癫痫中的作用
国外研究发现 KAR 在癫痫发病中的主要功能是促进兴奋性突触传递，影响 γ-氨基丁酸（gamma aminobutyric acid，GABA）能中间神经元的活性，整合突触内电流，突触重组，参与诱导兴奋性中毒作用[9-10]。GLUR5 是 KAR 中主要的也是研究最广泛的亚基，在突触传递和突触重组中有重要作用[11]。动物实验发现托吡酯（商品名：妥泰）不仅可选择性阻滞大鼠背外侧的杏仁核神经元的 GLUR5 受体而降低兴奋性突触后电流波幅，也能提高 GLUR5 的激动剂三磷酸腺苷酶所诱发的阵挛性癫痫的阈值[12]。Smolders 等[13]在动物实验和体外实验均证实 GLUR5 特异性受体抑制剂 Y33337 可以阻止癫痫活动，他们认为这种作用可能是通过阻滞谷氨酸介导的神经兴奋作用，增加 GABA 介导的抑制作用实现的。这些研究均支持 GLUR5 受体是癫痫活动的关键兴奋性环节的假说。GLUR5 对突触内电流的影响及其在突触传递中的具体作用机制尚需进一步深入研究。
3.2 GLUR5 在难治性颞叶癫痫患者海马及颞叶中的表达
Mathern 等[14]曾用原位杂交的方法探讨颞叶癫痫患者术后海马组织中 GLUR5-7 的 mRNA 表达水平，但该研究的主要缺点是使用尸体解剖后的海马组织作为对照组，很可能因海马组织难以耐受缺氧而导致 mRNA 总体水平下降，因而其研究结果可信度不高，该研究也未检测 KAR 的蛋白质表达水平。GLUR5 在人类难治性颞叶癫痫中是否被激活并不清楚，国内外少有临床研究涉及。因此，我们检测难治性颞叶癫痫患者颞叶皮质和海马组织中 GLUR5 的 mRNA 和蛋白质水平，了解 GLUR5 在人难治性颞叶癫痫脑组织中的表达情况，探讨其与难治性颞叶癫痫的关系。我们的研究在符合人体试验伦理要求的前提下采用活体组织作为对照，通过荧光定量 PCR 和蛋白质印迹法检测难治性颞叶癫痫患者术后颞叶组织和海马组织，结果发现 GLUR5 的 mRNA 水平和蛋白质表达水平在海马组织中异常升高，而颞叶皮质中 GLUR5 的表达水平与对照组相比差异无统计学意义，与 DeFelipe 等[15]的研究结果一致，提示尽管颞叶皮质也是难治性颞叶癫痫的病灶部位，但 GLUR5 的主要作用部位不在颞叶皮质，而是在颞叶癫痫的核心病变部位海马。海马一直是研究 GLUR5 的优势部位，我们的研究结果进一步证实 GLUR5 在人难治性颞叶癫痫中仍然是通过作用于海马参与难治性颞叶癫痫疾病发生机制。
3.3 GLUR5 在马桑内酯诱导的恒河猴癫痫模型中的表达
GLUR5 的异常表达是否也存在于非难治性癫痫并不清楚，在无法得到非难治性癫痫患者标本的情况下，我们选择在种属上与人类更接近，病理检查证实海马有病理改变，皮质电极也证实痫波来自颞叶海马的马桑内酯诱导的恒河猴癫痫模型作为研究对象，经过 3 个月反复诱导癫痫发作后处死，在其海马中进一步检测 GLUR5 和 GLUR6 蛋白质水平，结果发现恒河猴癫痫模型的海马中 GLUR5 蛋白质水平与对照组的差异无统计学意义。这一研究结果可能提示并非所有来源于颞叶的癫痫活动都与 GLUR 作用有关。我们的研究结果与 KA 诱导的癫痫大鼠模型实验结果存在差异。Ullal 等[16]研究发现在 KA 刺激后 72 h 和 180 d 后的大鼠海马中的 GLUR5 均持续升高。经马桑内酯诱导的癫痫模型致痫机制可能通过激活 L2 型钙离子通道和 N2 甲基 2D2 天冬氨酸受体介导的钙离子通道引起神经细胞内钙离子浓度升高抑制 GABA 功能，而引起癫痫发作[17]。在我们的研究中马桑内酯癫痫模型诱导过程仅 3 个月，目的在于建立非难治性癫痫模型；并且在恒河猴癫痫模型海马的病理结果中仅发现神经元的变性，而神经纤维染色并未发现苔藓纤维轴突出芽现象。而在难治性颞叶癫痫患者海马中观察到神经元丢失、坏死，苔藓纤维出芽现象。因此马桑内酯诱导的恒河猴癫痫模型海马中的 GLUR5 蛋白质水平与对照组比较差异无统计学意义，可能支持 GLUR5 的异常表达主要参与难治性癫痫的发生，也或许与种属差异或诱导剂有关。而 GLUR5 是否也参与其他慢性非难治性癫痫的发生，需进一步研究来证实。
与癫痫相关的 KAR 受体研究已经进入了分子水平，但仍有很多需要进一步探索的领域。如探讨研究 KAR 与难治性颞叶癫痫发生的因果关系，是因为 KAR 的表达异常导致癫痫的发生，还是因为癫痫发生后引起 KAR 的异常表达增高，导致难治性癫痫发生还不清楚。其次，GLUR5 在难治性癫痫患者中高表达说明其可能参与人难治性癫痫的发病机制，托吡酯是目前唯一可以阻滞 GLUR5 受体的抗癫痫药物，但是研究发现 GLUR5 拮抗剂对预防和阻止边缘叶所致的癫痫发作无明显效果。托吡酯具有阻滞钠离子通道，增加 GABA 介导的抑制作用和阻滞谷氨酸介导的神经兴奋作用，影响氯离子膜运转及钙离子通道阻滞的多重作用机制，其可能不只是通过选择性作用于 GLUR5 受体而发挥抗癫痫的药物作用。应进一步明确 GLUR5 与人难治性颞叶癫痫中的致病关系及其在难治性颞叶癫痫中的病理机制，为研发新的抗癫痫药物提供可能的理论依据。
