引用本文： 张冬雪, 龚道银, 代号, 俞尤嘉, 卢玫瑰, 曹永, 黄飞骏. 大鼠皮肤切创愈合过程中caspase-3、Toll样受体4的表达与时间相关性的研究. 华西医学, 2014, 29(10): 1874-1878. doi: 10.7507/1002-0179.20140567 复制
损伤时间的推断一直是法医学的重点和难点。近来皮肤创伤愈合过程分子机制的研究发现，创伤愈合各阶段具有一定的时序性，且被国内外法医学者广泛用于皮肤创口的“年龄”推断[1, 2]，但目前仍未找到理想的蛋白因子来推断损伤时间。
有研究发现Toll样受体4（TLR4）、caspase-3可能参与小鼠海马区神经细胞的凋亡[3, 4]；已有研究发现TLR4可能参与促进增生性瘢痕的形成[5, 6]。推测TLR4和caspase-3可能在皮肤创伤愈合过程中存在某种关系，查阅文献尚未见TLR4和caspase-3的表达在皮肤创伤愈合各个阶段存在某种相关性的研究报道。因此，本研究通过建立大鼠皮肤切创模型，应用免疫组织化学染色技术及统计学方法，观察分析caspase-3、TLR4 在皮肤创伤后的表达和损伤时间的规律及其死后稳定性，并对caspase-3与TLR4阳性表达的相关性进行分析，探究在皮肤创伤愈合各个阶段caspase-3和TLR4的表达是否存在相关性，从而为法医学损伤时间的推断提供指标和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物分组
健康清洁级Sprague-Dawley成年大鼠63只（四川大学实验动物中心提供），雌雄不限，体质量为200～220 g，采用随机数字随机分为正常对照组（3只）、生前造创组（33只）、死后造创组（12只）和死后稳定性组（15只）。
1.1.2 主要试剂
TLR4 小鼠抗单克隆抗体（英国Abcam公司，货号ab22048），caspase-3兔抗多克隆抗体（美国CST公司，货号9662#），二步法抗兔/鼠通用型免疫组织检测试剂盒（基因科技上海有限公司，编号GK500705）。
1.2 动物模型建立
① 生前造创组：用乙醚麻醉大鼠后，剪毛备皮大鼠背部造创区。常规消毒后用无菌手术刀在大鼠背部做一与脊柱平行的长约2 cm切口，深达肌肉筋膜；创面自然止血，不包扎、不施药，保持伤口干燥。将大鼠置无菌室单笼饲养，给予消毒的食物和水。分别于造创后 0、0.5、1.5、3、6、12 h和1、3、5、7、10 d共11个时间点将大鼠（每次3只）断颈处死，即刻于创口处取一2.0 cm×1.5 cm大小皮肤组织。② 死后造创组：同前麻醉、剪毛备皮，将大鼠断颈处死，分别于死后0、10、30、90 min共4个时间点在大鼠（每次3只）背部行长约2 cm切口，深达肌肉筋膜；创面不包扎、不施药，保持伤口干燥；均于造创后0.5 h取一2.0 cm×1.5 cm 大小创口处皮肤组织。③ 正常对照组：处理同实验组，但不行造创手术，大鼠断颈处死后取与造创组大鼠相同部位、相同大小皮肤组织。④ 死后稳定性组：同生前造创组作大鼠背部切创及伤后处理，造创后3 d断颈处死，置于25℃温度环境中；分别于死后0 h、0.5 h、12 h、2 d、4 d于创口处（每次3只）取一2.0 cm×1.5 cm大小皮肤组织。
1.3 染色方法
将所取皮肤检材及时放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中固定24 h，石蜡包埋后5 μm厚度连续切片3张。苏木精-伊红（HE）染色按常规方法进行；另2张贴于黏附载玻片，用于免疫组织化学染色，枸橼酸抗原修复液（pH值6.0）95℃水浴修复，采用 ChemMateTM Envision+HRP/DAB，兔/鼠二步法染色，具体步骤同试剂盒说明。染色过程另以磷酸盐缓冲液代替一抗作为空白对照。
1.4 阳性细胞计数
caspase-3及TLR4阳性反应物呈棕黄色细颗粒状，主要定位于细胞膜和（或）细胞质。光学显微镜（×400）下随机选择5个视野，计数中性粒细胞、单核-吞噬细胞系统、淋巴细胞及成纤维细胞的阳性细胞数，计算每个视野中阳性细胞与此4种细胞总数的比值。
1.5 统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行统计分析。数据用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用LSD检验；两变量之间相关关系行Pearson相关分析。以P值＜0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 创口皮肤组织基本病理变化
各组基本病理变化如下：① 生前造创组：伤后 0.5～1.5 h，创缘真皮毛细血管扩张充血，毛囊周围见少量中性粒细胞；伤后3～12 h，真皮毛细血管明显扩张充血，炎细胞逐渐增多，以中性粒细胞为主，创缘上皮均质化，细胞核消失；伤后1 d，创缘组织干燥，以渗出的炎性细胞为主的肉芽组织开始形成，并向创口长入，创缘可见大量单核细胞浸润；伤后3 d，肉芽组织形成，成纤维细胞开始增生，炎性细胞以单核-巨噬细胞为主；伤后5～7 d，肉芽组织逐渐成熟纤维化，从深筋膜呈楔形向创口内生长，中性粒细胞进一步减少，淋巴细胞开始浸润，成纤维细胞增加；伤后10 d，创口基本愈合，创区单核-巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞数量明显减少，细胞间质成分开始增多，瘢痕组织逐渐形成。② 正常对照组及死后造创组无生前造创组改变。③ 死后稳定性组：受温度及死亡时间的影响，死后30 min，创口改变同死后即刻；死后12 h，尸体僵硬，出现皮下局灶性的蜂窝状空腔结构，创区组织细胞开始自溶；死后2 d，尸僵缓解，尸体肿胀，恶臭，创周皮肤变绿，创区组织细胞自溶加剧，边缘结构不清；死后4 d，尸体腐败加剧，表皮与真皮易于剥离。
2.2 切创区及其周边caspase-3及TLR4的表达
① 正常对照组：表皮层、毛囊及皮脂腺细胞caspase-3及TLR4呈阳性表达。② 死后造创组：细胞表达结果与正常对照组相似。③ 生前造创组：伤后0.5 h，在创缘毛囊周围中性粒细胞中可见少量caspase-3及TLR4阳性表达；伤后1.5～6.0 h，中性粒细胞及单核-巨噬细胞逐渐增多，caspase-3及TLR4阳性细胞率缓慢增加；伤后12 h，中性粒细胞增多且大部分细胞caspase-3及TLR4表达阳性；伤后1 d，创口周围的单核-巨噬细胞增多，阳性表达增加，部分中性粒细胞呈阳性；伤后3～5 d，caspase-3及TLR4主要表达于成纤维细胞及单核-巨噬细胞；伤后7～10 d，炎细胞逐渐减少，阳性表达主要在成纤维细胞。④ 死后稳定性组：caspase-3及TLR4阳性表达与死后0 h基本相同。见图 1。
图1
切创区及其周边caspase-3及TLR4的表达 a. 生前造创组1 d时caspase-3表达情况（免疫组织化学染色×400） b. 生前造创组1 d时TLR-4表达情况（免疫组织化学染色×400） c. 生前造创组5 d时caspase-3表达情况（免疫组织化学染色×400） d. 生前造创组5 d时TLR4表达情况（免疫组织化学染色×400） e. 死后稳定性组2 d时caspase-3表达情况（免疫组织化学染色×400） f. 死后稳定性组2 d时TLR4表达情况（免疫组织化学染色×400） g. 生前造创组3 d时表达情况（HE×40） h.生前造创组10 d时表达情况（HE×40）
2.3 阳性细胞计数及统计学分析
2.3.1 caspase-3阳性细胞率
生前造创组除0 h组外，各实验组与正常对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），caspase-3阳性率在3 d达到峰值。见图 2。
图2
caspase-3、TLR4阳性细胞率变化趋势图
伤后各时间点相邻两组之间caspase-3阳性细胞率相比差异均有统计学意义（P＜0.05) ，其中1.5、3及12 h～10 d组与其他各时间组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。死后造创组与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。死后稳定性组caspase-3阳性细胞率呈缓慢下降趋势，但与死后即刻比较以及各相邻两组间比较均无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。
表1
生前造创组caspase-3及TLR4阳性细胞百分率（n=33，
表2
死后稳定性组caspase-3及TLR4阳性细胞百分率（n=15，%，2.3.2 TLR4阳性细胞率
生前造创组除0 h组外，各实验组与空白对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），TLR4阳性率在3 d达到峰值（图 2）；伤后0.5 h～5 d各时间点相邻两组之间TLR4阳性细胞率相比差异均有统计学意义（P＜0.05) ，其中0.5、6、12 h及3 d组与其他各时间组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表 1。死后造创组与正常对照组比较差异无统计学意义。死后稳定性组：TLR4阳性细胞率呈缓慢下降趋势，但与死后即刻比较以及各相邻两组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表 2。
2.3.3 相关性分析
生前造创后皮肤组织caspase-3阳性细胞率与TLR4阳性细胞率呈正相关（r=0.970，P＜0.05）。
3 讨论
近来发现Toll样受体家族的某些成员，尤其是TLR4对于无菌性损伤后释放的众多内源性分子（如高迁移率族蛋白1、氧自由基、细胞外基质降解产物等）即损伤相关分子模式有反应，通过激活核因子-κB而诱导细胞因子的产生。有研究表明，外周组织损害所产生的危险信号能被TLR4迅速识别和反应，对创伤后炎症反应的启动具有重要作用[7, 8]。TLR4既表达在巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞等非特异性免疫细胞上，又表达在Ｔ淋巴细胞和Ｂ淋巴细胞这类特异性免疫细胞上。
目前已经证明的细胞凋亡通路至少有线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径。作为caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，caspase-3是细胞凋亡过程中的主要效应因子，它的活化标志着凋亡进入不可逆阶段。李俊等[9]通过建立急性胰腺炎模型，发现caspase-3可能参与中性粒细胞的凋亡。在组织损伤和炎症过程中，caspase-3对中性粒细胞及其他滞留细胞的凋亡起着重要作用[5, 10]。
佟月等[4]、Lotze等[11]通过对小鼠脑缺血再灌注损伤模型研究发现，海马区TLR4阻断组中caspase-3蛋白表达明显低于缺血再灌注组，且凋亡细胞数较后者明显减少，提示阻断TLR4，可能会减轻小鼠脑缺血再灌注损伤中的海马区神经细胞的凋亡。Tstung等[12]、郝诚诚等[13]研究发现，过度训练可通过上调TLR4的表达，强化Fas死亡受体凋亡通路，进而诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡。由以上研究推知在细胞凋亡信号通路中，TLR4可能处于caspase-3的上游，参与诱导细胞凋亡。
本研究结果显示，正常对照组中caspase-3、TLR4在表皮层、毛囊及皮脂腺细胞有表达，生前造创组伤后0 h组及死后损伤组中染色结果与正常对照组基本相同，说明caspase-3、TLR4在正常的皮肤组织中已有表达，提示其可能与上述细胞的凋亡和自我更新有关。
大鼠生前造创组自0.5 h开始caspase-3、TLR4即有阳性表达，而后逐渐增加，两者的阳性细胞率均在3 d时达峰值，后逐渐降低，两者变化趋势呈正相关；caspase-3、TLR4阳性细胞率的变化趋势与杜宇等[14]、楼旭鹏等[15]的研究结果大致相同。提示caspase-3、TLR4可能参与中性粒细胞、单核-巨噬细胞、淋巴细胞及成纤维细胞的凋亡。死后稳定性组结果显示，在25℃环境中，caspase-3、TLR4的表达在各时间点与死后即刻比较均无统计学意义，且各组间比较亦无统计学意义（P＞0.05），直至死后4 d仍呈阳性表达，表明其具有较好的稳定性。以上揭示出的caspase-3、TLR4表达的时序性变化规律及稳定性使其可以作为皮肤损伤时间推断的指标。
本研究证实了在大鼠皮肤切创愈合过程中，TLR4与caspase-3的表达有相关性，且早期炎性细胞稳定表达TLR4较caspase-3显著，提示TLR4可能参与促进caspase-3的产生，通过两者表达量的变化来协调炎症与凋亡，促进创口的愈合。查阅文献未见关于TLR4诱导caspase-3表达及参与细胞凋亡程序具体途径的相关报道，还有待进一步研究。综上，TLR4、caspase-3可共同作为损伤时间推断的指标，早期皮肤损伤时间的推断可首选TLR4。具体到法医学实践中的运用，基于实验大鼠与人的种属不同，caspase-3、TLR4在人体的表达是否存在差异也有待进一步研究。
损伤时间的推断一直是法医学的重点和难点。近来皮肤创伤愈合过程分子机制的研究发现，创伤愈合各阶段具有一定的时序性，且被国内外法医学者广泛用于皮肤创口的“年龄”推断[1, 2]，但目前仍未找到理想的蛋白因子来推断损伤时间。
有研究发现Toll样受体4（TLR4）、caspase-3可能参与小鼠海马区神经细胞的凋亡[3, 4]；已有研究发现TLR4可能参与促进增生性瘢痕的形成[5, 6]。推测TLR4和caspase-3可能在皮肤创伤愈合过程中存在某种关系，查阅文献尚未见TLR4和caspase-3的表达在皮肤创伤愈合各个阶段存在某种相关性的研究报道。因此，本研究通过建立大鼠皮肤切创模型，应用免疫组织化学染色技术及统计学方法，观察分析caspase-3、TLR4 在皮肤创伤后的表达和损伤时间的规律及其死后稳定性，并对caspase-3与TLR4阳性表达的相关性进行分析，探究在皮肤创伤愈合各个阶段caspase-3和TLR4的表达是否存在相关性，从而为法医学损伤时间的推断提供指标和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物分组
健康清洁级Sprague-Dawley成年大鼠63只（四川大学实验动物中心提供），雌雄不限，体质量为200～220 g，采用随机数字随机分为正常对照组（3只）、生前造创组（33只）、死后造创组（12只）和死后稳定性组（15只）。
1.1.2 主要试剂
TLR4 小鼠抗单克隆抗体（英国Abcam公司，货号ab22048），caspase-3兔抗多克隆抗体（美国CST公司，货号9662#），二步法抗兔/鼠通用型免疫组织检测试剂盒（基因科技上海有限公司，编号GK500705）。
1.2 动物模型建立
① 生前造创组：用乙醚麻醉大鼠后，剪毛备皮大鼠背部造创区。常规消毒后用无菌手术刀在大鼠背部做一与脊柱平行的长约2 cm切口，深达肌肉筋膜；创面自然止血，不包扎、不施药，保持伤口干燥。将大鼠置无菌室单笼饲养，给予消毒的食物和水。分别于造创后 0、0.5、1.5、3、6、12 h和1、3、5、7、10 d共11个时间点将大鼠（每次3只）断颈处死，即刻于创口处取一2.0 cm×1.5 cm大小皮肤组织。② 死后造创组：同前麻醉、剪毛备皮，将大鼠断颈处死，分别于死后0、10、30、90 min共4个时间点在大鼠（每次3只）背部行长约2 cm切口，深达肌肉筋膜；创面不包扎、不施药，保持伤口干燥；均于造创后0.5 h取一2.0 cm×1.5 cm 大小创口处皮肤组织。③ 正常对照组：处理同实验组，但不行造创手术，大鼠断颈处死后取与造创组大鼠相同部位、相同大小皮肤组织。④ 死后稳定性组：同生前造创组作大鼠背部切创及伤后处理，造创后3 d断颈处死，置于25℃温度环境中；分别于死后0 h、0.5 h、12 h、2 d、4 d于创口处（每次3只）取一2.0 cm×1.5 cm大小皮肤组织。
1.3 染色方法
将所取皮肤检材及时放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中固定24 h，石蜡包埋后5 μm厚度连续切片3张。苏木精-伊红（HE）染色按常规方法进行；另2张贴于黏附载玻片，用于免疫组织化学染色，枸橼酸抗原修复液（pH值6.0）95℃水浴修复，采用 ChemMateTM Envision+HRP/DAB，兔/鼠二步法染色，具体步骤同试剂盒说明。染色过程另以磷酸盐缓冲液代替一抗作为空白对照。
1.4 阳性细胞计数
caspase-3及TLR4阳性反应物呈棕黄色细颗粒状，主要定位于细胞膜和（或）细胞质。光学显微镜（×400）下随机选择5个视野，计数中性粒细胞、单核-吞噬细胞系统、淋巴细胞及成纤维细胞的阳性细胞数，计算每个视野中阳性细胞与此4种细胞总数的比值。
1.5 统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行统计分析。数据用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用LSD检验；两变量之间相关关系行Pearson相关分析。以P值＜0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 创口皮肤组织基本病理变化
各组基本病理变化如下：① 生前造创组：伤后 0.5～1.5 h，创缘真皮毛细血管扩张充血，毛囊周围见少量中性粒细胞；伤后3～12 h，真皮毛细血管明显扩张充血，炎细胞逐渐增多，以中性粒细胞为主，创缘上皮均质化，细胞核消失；伤后1 d，创缘组织干燥，以渗出的炎性细胞为主的肉芽组织开始形成，并向创口长入，创缘可见大量单核细胞浸润；伤后3 d，肉芽组织形成，成纤维细胞开始增生，炎性细胞以单核-巨噬细胞为主；伤后5～7 d，肉芽组织逐渐成熟纤维化，从深筋膜呈楔形向创口内生长，中性粒细胞进一步减少，淋巴细胞开始浸润，成纤维细胞增加；伤后10 d，创口基本愈合，创区单核-巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞数量明显减少，细胞间质成分开始增多，瘢痕组织逐渐形成。② 正常对照组及死后造创组无生前造创组改变。③ 死后稳定性组：受温度及死亡时间的影响，死后30 min，创口改变同死后即刻；死后12 h，尸体僵硬，出现皮下局灶性的蜂窝状空腔结构，创区组织细胞开始自溶；死后2 d，尸僵缓解，尸体肿胀，恶臭，创周皮肤变绿，创区组织细胞自溶加剧，边缘结构不清；死后4 d，尸体腐败加剧，表皮与真皮易于剥离。
2.2 切创区及其周边caspase-3及TLR4的表达
① 正常对照组：表皮层、毛囊及皮脂腺细胞caspase-3及TLR4呈阳性表达。② 死后造创组：细胞表达结果与正常对照组相似。③ 生前造创组：伤后0.5 h，在创缘毛囊周围中性粒细胞中可见少量caspase-3及TLR4阳性表达；伤后1.5～6.0 h，中性粒细胞及单核-巨噬细胞逐渐增多，caspase-3及TLR4阳性细胞率缓慢增加；伤后12 h，中性粒细胞增多且大部分细胞caspase-3及TLR4表达阳性；伤后1 d，创口周围的单核-巨噬细胞增多，阳性表达增加，部分中性粒细胞呈阳性；伤后3～5 d，caspase-3及TLR4主要表达于成纤维细胞及单核-巨噬细胞；伤后7～10 d，炎细胞逐渐减少，阳性表达主要在成纤维细胞。④ 死后稳定性组：caspase-3及TLR4阳性表达与死后0 h基本相同。见图 1。
图1
切创区及其周边caspase-3及TLR4的表达 a. 生前造创组1 d时caspase-3表达情况（免疫组织化学染色×400） b. 生前造创组1 d时TLR-4表达情况（免疫组织化学染色×400） c. 生前造创组5 d时caspase-3表达情况（免疫组织化学染色×400） d. 生前造创组5 d时TLR4表达情况（免疫组织化学染色×400） e. 死后稳定性组2 d时caspase-3表达情况（免疫组织化学染色×400） f. 死后稳定性组2 d时TLR4表达情况（免疫组织化学染色×400） g. 生前造创组3 d时表达情况（HE×40） h.生前造创组10 d时表达情况（HE×40）
2.3 阳性细胞计数及统计学分析
2.3.1 caspase-3阳性细胞率
生前造创组除0 h组外，各实验组与正常对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），caspase-3阳性率在3 d达到峰值。见图 2。
图2
caspase-3、TLR4阳性细胞率变化趋势图
伤后各时间点相邻两组之间caspase-3阳性细胞率相比差异均有统计学意义（P＜0.05) ，其中1.5、3及12 h～10 d组与其他各时间组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。死后造创组与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。死后稳定性组caspase-3阳性细胞率呈缓慢下降趋势，但与死后即刻比较以及各相邻两组间比较均无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。
表1
生前造创组caspase-3及TLR4阳性细胞百分率（n=33，
表2
死后稳定性组caspase-3及TLR4阳性细胞百分率（n=15，%，2.3.2 TLR4阳性细胞率
生前造创组除0 h组外，各实验组与空白对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），TLR4阳性率在3 d达到峰值（图 2）；伤后0.5 h～5 d各时间点相邻两组之间TLR4阳性细胞率相比差异均有统计学意义（P＜0.05) ，其中0.5、6、12 h及3 d组与其他各时间组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表 1。死后造创组与正常对照组比较差异无统计学意义。死后稳定性组：TLR4阳性细胞率呈缓慢下降趋势，但与死后即刻比较以及各相邻两组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表 2。
2.3.3 相关性分析
生前造创后皮肤组织caspase-3阳性细胞率与TLR4阳性细胞率呈正相关（r=0.970，P＜0.05）。
3 讨论
近来发现Toll样受体家族的某些成员，尤其是TLR4对于无菌性损伤后释放的众多内源性分子（如高迁移率族蛋白1、氧自由基、细胞外基质降解产物等）即损伤相关分子模式有反应，通过激活核因子-κB而诱导细胞因子的产生。有研究表明，外周组织损害所产生的危险信号能被TLR4迅速识别和反应，对创伤后炎症反应的启动具有重要作用[7, 8]。TLR4既表达在巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞等非特异性免疫细胞上，又表达在Ｔ淋巴细胞和Ｂ淋巴细胞这类特异性免疫细胞上。
目前已经证明的细胞凋亡通路至少有线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径。作为caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，caspase-3是细胞凋亡过程中的主要效应因子，它的活化标志着凋亡进入不可逆阶段。李俊等[9]通过建立急性胰腺炎模型，发现caspase-3可能参与中性粒细胞的凋亡。在组织损伤和炎症过程中，caspase-3对中性粒细胞及其他滞留细胞的凋亡起着重要作用[5, 10]。
佟月等[4]、Lotze等[11]通过对小鼠脑缺血再灌注损伤模型研究发现，海马区TLR4阻断组中caspase-3蛋白表达明显低于缺血再灌注组，且凋亡细胞数较后者明显减少，提示阻断TLR4，可能会减轻小鼠脑缺血再灌注损伤中的海马区神经细胞的凋亡。Tstung等[12]、郝诚诚等[13]研究发现，过度训练可通过上调TLR4的表达，强化Fas死亡受体凋亡通路，进而诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡。由以上研究推知在细胞凋亡信号通路中，TLR4可能处于caspase-3的上游，参与诱导细胞凋亡。
本研究结果显示，正常对照组中caspase-3、TLR4在表皮层、毛囊及皮脂腺细胞有表达，生前造创组伤后0 h组及死后损伤组中染色结果与正常对照组基本相同，说明caspase-3、TLR4在正常的皮肤组织中已有表达，提示其可能与上述细胞的凋亡和自我更新有关。
大鼠生前造创组自0.5 h开始caspase-3、TLR4即有阳性表达，而后逐渐增加，两者的阳性细胞率均在3 d时达峰值，后逐渐降低，两者变化趋势呈正相关；caspase-3、TLR4阳性细胞率的变化趋势与杜宇等[14]、楼旭鹏等[15]的研究结果大致相同。提示caspase-3、TLR4可能参与中性粒细胞、单核-巨噬细胞、淋巴细胞及成纤维细胞的凋亡。死后稳定性组结果显示，在25℃环境中，caspase-3、TLR4的表达在各时间点与死后即刻比较均无统计学意义，且各组间比较亦无统计学意义（P＞0.05），直至死后4 d仍呈阳性表达，表明其具有较好的稳定性。以上揭示出的caspase-3、TLR4表达的时序性变化规律及稳定性使其可以作为皮肤损伤时间推断的指标。
本研究证实了在大鼠皮肤切创愈合过程中，TLR4与caspase-3的表达有相关性，且早期炎性细胞稳定表达TLR4较caspase-3显著，提示TLR4可能参与促进caspase-3的产生，通过两者表达量的变化来协调炎症与凋亡，促进创口的愈合。查阅文献未见关于TLR4诱导caspase-3表达及参与细胞凋亡程序具体途径的相关报道，还有待进一步研究。综上，TLR4、caspase-3可共同作为损伤时间推断的指标，早期皮肤损伤时间的推断可首选TLR4。具体到法医学实践中的运用，基于实验大鼠与人的种属不同，caspase-3、TLR4在人体的表达是否存在差异也有待进一步研究。
