免疫荧光可定性分析细胞内蛋白核转位现象, NF-κB/p65蛋白核转位提示NF-κB信号通路的活化, 我们尝试运用自主研发设计的免疫荧光分析软件计算荧光图像中胞核和胞质位置的荧光值变化, 定量分析核转位情况, 并通过蛋白质免疫印迹法验证软件分析结果。应用该软件分析内毒素诱导0.5、1、2和4 h后原代人脐静脉内皮细胞的NF-κB信号通路活化, 结果提示2 h为核转位高峰期, 与蛋白质免疫印迹法验证结果一致, 表明自主研发的免疫荧光分析软件可应用于免疫荧光的定量分析。
引用本文： 修敏, 何凤, 娄远蕾, 徐露, 熊洁琦, 王平, 刘丝荪, 郭菲. 免疫荧光检测核因子-κB活化的定量分析. 生物医学工程学杂志, 2015, 32(3): 669-674. doi: 10.7507/1001-5515.20150121 复制
引言
NF-κB信号通路在免疫应答、细胞存活和增殖分化等方面发挥重要调控作用，通路的激活表现在细胞内多种蛋白和酶的级联式反应以及相关基因的转录调控[1]。Rogers等[2]在研究一氧化氮对肿瘤坏死因子-α诱导(human umbilical vein endothelial cells, HUVFCs)的NF-κB信号通路的激活过程中发现NF-κB/p65蛋白核转位“震荡现象”，NF-κB/p65核转位作为调控转录的始动因素，是我们研究NF-κB信号通路的关键。免疫荧光是观察细胞内蛋白核转位较直观的实验方法[3]，但多限于主观定性判断荧光图片结果，具有自主知识产权的、个性化的荧光定量分析软件相对缺乏，结合细胞特征而研究设计的荧光分析软件可以相对定量分析免疫荧光图像中的核转位现象，协助探讨NF-κB/p65蛋白的核转位规律。本文将荧光分析软件应用到免疫荧光图像的定量及定位分析中，研究内毒素激活原代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的NF—κB信号通路的时效规律。
1 材料与方法
1.1 主要试剂材料与仪器
新生儿脐带取自于南昌大学第一附属医院妇产科正常足月新生儿，M199培养基购自HyClone公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)、0.25%胰酶购自Gibco公司；牛血清白蛋白、II型胶原酶购自索来宝公司；脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)(E.coil O55B5)购自Sigma公司；内皮细胞生长复合物(endothelial cell growth supplement, ECGs)购自BD公司；用于免疫荧光实验的兔抗NF-κB/p65抗体购自中山金桥公司；兔抗VIII相关抗体购自博士德生物；异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记的驴抗兔IgG购自Invitrogen公司；用于Western blot实验的鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体、鼠抗NF-κB/p65(A)抗体、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的山羊抗鼠IgG均购自Santa Cruz公司；化学发光试剂盒购自Pierce公司。
IX71型荧光显微镜为Olympus公司产品；垂直电泳系统及转印系统、全自动凝胶成像系统均为Bio-Rad公司产品。
所有细胞培养相关实验用品均经过去热源处理。
1.2 实验方法
1.2.1 原代分离培养HUVECs及鉴定
生理盐水冲洗脐静脉，消化液(1 :1.01%Ⅱ型胶原酶：0.25%胰酶)充盈脐静脉，于37℃消化30 min，收集消化液和冲洗液，1 200 r/min离心收集细胞，用含1%青、链霉素、100μg/ml ECGs和20% FBS的M199完全培养基重悬细胞并接种于培养瓶，置37℃、5% CO2的孵箱内培养，免疫荧光检测胞质Ⅷ因子相关抗原以鉴定内皮细胞[4-5]。
1.2.2 免疫荧光染色
细胞消化传代，种入24孔板爬片。待细胞贴壁后取均匀分布的单层细胞爬片随机分为6组，分别予LPS(1μg/mL)处理0.5、1、2、4 h；空白对照组无LPS处理；阴性对照组无LPS处理和一抗处理。各组处理后予4%多聚甲醛4℃固定爬片10 min，0.5% TritonX-100透化处理10 min，1%牛血清白蛋白37℃封闭30 min。行细胞免疫荧光染色，分别滴加一抗(兔抗NF-κB/p65单克隆抗体，1 :50稀释，阴性对照不加一抗)4℃过夜，次日取出37℃孵育1 h，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)洗涤三次后滴加二抗(FITC标记的驴抗兔IgG，1 000倍稀释)37℃孵育1 h，PBS洗涤三次，4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)复染2 min，PBS洗涤后用50%甘油封片。各组于荧光显微镜同一曝光条件(FITC曝光时间1/2.8 s，ISO 1600)下观察结果并拍照。各实验组均设三个复孔爬片。
1.2.3 免疫荧光图片收集、软件分析
该自主研发的软件是基于VC++6.0开发平台实现的具有菜单式图像界面的系统，主要功能模块包括以下四个部分，如图 1所示：①图像获取：荧光显微镜下每组随机取5张照片获取图片信息，添加图像到主程序中。②图像预处理：通过灰度化、二值化、均值滤波、膨胀和腐蚀等操作处理图像，减少图像噪声。③图像分割：提取细胞核二值图像进行距离变换，将像素点位置信息转化为灰度信息[6]，并提取出能代表各个细胞的“种子点”[7]，将种子点图与细胞二值图结合找到细胞图中各个细胞的所在位置并重构细胞距离图，最后利用“模拟浸没”的方法实现分水岭分割[8]，采用同样的分割方法进行粘连细胞核的分割，最后通过二值图像的四连通域方法，完成各细胞的标号。④参数提取：分别计算各个细胞和细胞核的面积及荧光强度，在得到的细胞荧光强度和细胞核荧光强度的基础上，计算得到细胞质的荧光强度，从而得到胞核与胞质的荧光强度比。其中，每个细胞的面积等于对应标号的总像素点个数，而细胞的荧光强度等于对应标号的像素点灰度总值除以细胞面积。同理得到细胞核的各个参数。细胞质荧光强度=(细胞荧光强度-细胞核荧光强度)/(细胞面积-细胞核面积)。
图1
免疫荧光分析软件设计模块
Figure1.
Design module of immuno-fluorescence analysis software
1.2.4 Western blot验证NF-κB/p65蛋白表达变化
原代HUVECs随机分为5组，分别予LPS(1μg/mL)处理0.5、1、2、4 h；空白对照组(0 h组)无LPS处理。分别提取各组总蛋白和胞质、胞核蛋白，于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至硝酸纤维膜上，室温下5 %牛奶封闭1 h，加入鼠抗NF-κB/p65(A)抗体(一抗，稀释比为1 :250)和HRP标记山羊抗鼠IgG(二抗，稀释比1 :2 000)，内参为鼠抗GAPDH抗体(稀释比为1 :500)。一抗加入后于4℃孵育过夜。洗涤后加入相应的二抗室温孵育2 h。洗涤后应用化学发光液于全自动凝胶成像系统检测杂交信号，Image J 1.44p软件定量分析比较条带结果。
1.3 统计学处理
数据采用SPSS 17.0软件分析, 用
2 实验结果分析
2.1 HUVECs形态与鉴定
原代HUVECs生长呈典型铺路石样排列[见图 2(a)]，Ⅷ因子相关抗原鉴定[见图 2(b)]阳性，与阴性对照组[见图 2(c)]相比，原代HUVECs细胞质中可见高强度的绿色荧光，胞核内荧光极弱。
图2
原代HUVECs的细胞形态与分离鉴定
(a)光镜下原代HUVECs形态；(b)荧光显微镜下Ⅷ因子鉴定内皮细胞；(c)阴性对照
Figure2. Morphology and identification of primary HUVECs(a) morphology of primary HUVECs under light microscope; (b) primary HUVECs identification with factorⅧunder fluorescence microscope; (c) negative control
2.2 免疫荧光染色法检测LPS诱导HUVECs的核因子-κB激活
如图 3所示，荧光镜下HUVECs于爬片上多聚团生长，每张爬片在荧光显微镜(40×)下随机选取5个不重叠视野观察，结果提示：与空白对照组相比，LPS各组随刺激时间增加整体荧光强度逐渐增加，胞核内荧光逐渐聚集，整体荧光强度于4 h达高峰，核转位现象在2 h组和4 h组较显著。而在未添加NF-κB/p65(A)一抗的阴性对照组中未见FITC绿色荧光，可排除二抗非特异性结合对实验的干扰。
图3
荧光显微镜下观察LPS刺激原代HUVECs后NF-κB/p65蛋白在细胞中的表达和定位
Figure3.
Localization and expression of NF-κB/p65 in HUVECs stimulated with LPS observed under fluorescence microscope
2.3 免疫荧光软件分析荧光图像检测NF-κB/p65蛋白的核转位现象
如表 1所示，LPS刺激后各组总荧光强度逐渐增强，4 h组总荧光值最高，1 h、2 h和4 h组总荧光值与空白对照组相比均有显著差异(P＜0.01)；胞核/胞质荧光比值2 h组最高，与空白对照组相比具有显著性差异(P＜0.01)。
表1
免疫荧光分析软件检测荧光值结果
Table1.
Fluorescence value of each group determined by fluorescence analysis software
2.4 Western blot检验NF-κB/p65蛋白表达变化
如图 4(a)所示，与空白对照组(0 h组)相比，总NF-κB/p65蛋白随着LPS刺激时间延长表达逐渐升高，4 h为表达高峰；胞核、胞质NF-κB/p65蛋白表达也随LPS刺激时间延长逐渐增加。图 5(b)的Image J分析结果显示：总蛋白表达上调，1 h和4 h与空白对照组相比具有显著性差异(P＜0.01)，胞质、胞核蛋白条带比照其各自对应内参后，胞核/胞质比值于2 h组明显高于空白对照组，且具有显著性差异(P＜0.01)。
图4
LPS刺激HUVECs后NF-κB/p65蛋白的表达变化
(a) Western blot检测各组NF-κB/p65蛋白的表达；(b)Image J软件分析Western blot实验结果(* *各实验组0.5 h组、1 h组、2 h组、4 h组分别与空白对照组0 h组比较,
(a) expression of NF-κB/p65 detected by Western blot; (b) results of Western blot analyzed by Image J (* *group 0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h compared with group 0 h respectively,
3 讨论与结论
免疫荧光是观察细胞内蛋白核转位现象最直观的方法，但主要通过主观定性判断荧光结果，难以量化分析。既往有电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)半定量方法检测NF-κB核转位，但实验步骤繁多复杂，需要使用放射性同位素及大量细胞，因此分析原代细胞显得尤为困难[9-11]。也有研究应用激光共聚焦显微镜定量分析细胞内目标荧光蛋白变化[12]，但鉴于实验条件的限制，我们希望在运用现有普通荧光显微镜的基础上，寻求科学的图像分析软件，为免疫荧光的定量分析提供更可靠的依据。目前市场上图像分析软件颇多：有关研究运用MetaMorph软件计算荧光素标记的p65蛋白的总荧光密度值的分布，并结合NF-κB活性试剂盒辅助分析核转位特征[2]，事实上NF-κB活性试剂盒即是EMSA和酶联免疫原理的结合，但其实验成本高且无法同时分析胞质与胞核蛋白表达关系；Noursadeghi等[13]的研究中运用Image J定量分析巨噬细胞荧光图片，但巨噬细胞多分散单个分布，而HUVECs常呈铺路石样紧密排列生长，准确分割成片细胞图像存在困难；此外，也有相关研究结合应用软件Simple PCI、Imagepro-Plus 6.0和Image J半定量分析细胞骨架蛋白免疫荧光图像，成功分割提取单个细胞[14]，通过比较细胞骨架分形维数观察微管蛋白表达变化，但多软件图像处理过程相对复杂，且参数的选取直接影响实验结果，所以对于难以分割的成片HUVECs荧光图像，胞质胞核参数的独立提取和定位还难以实现。
因此我们尝试设计VC++6.0为平台的免疫荧光分析软件，考虑HUVECs的生长特性采用基于“种子点”优化的分水岭分割算法，实现成片生长的细胞的有效分离；同时通过胞核DAPI蓝色荧光较精确定位胞核位置，以实现对图片中细胞个数、面积、圆度因子、灰度均值、荧光强度等参数的独立提取，通过上述方法得到的细胞总荧光值和胞核胞质荧光比值，进一步判断HUVECs中NF-κB/p65蛋白的表达变化和核转位现象的发生特点。
然而，由于该软件细胞分割模块是基于对应的细胞核图像，而即便是激光共聚焦显微镜下获取的荧光图像中仍存在细胞核图像荧光亮度不均匀的问题，在进行OTSU(最大熵阈值分割法)阈值处理的时候，因部分细胞核灰度值较低，当其低于自适应阈值时，会被认为是背景不被识别而出现部分细胞的漏割现象。目前还没有完成适用于将所有细胞图像都完全分割的技术，我们的研究结果显示个别低染细胞漏处理在一定程度上不会影响对整体荧光趋势的判断，同时我们的软件也在进一步完善中，通过合理化阈值尽可能识别并分割所有细胞。
本实验以LPS刺激原代HUVECs，尝试运用自主研发的免疫荧光分析软件探讨NF-κB/p65核转位规律。NF-κB作为细胞内广泛存在转录因子，可与抑制因子IκB结合成三聚体以失活的状态存在于细胞质中，当细胞受到各种因素刺激时，可激活IκB激酶与NF-κB/p65蛋白解离，活化的NF-κB/p65被释放并进入细胞核中激活转录，参与多种基因的调控[15-16]。上述实验分析显示：荧光镜下主观判断、荧光分析软件检测以及Western blot实验三种结果表现出较好的一致性，即各LPS组细胞NF-κB/p65总蛋白表达上调，于4 h表达水平最高，2 h出现核转高峰。NF-κB信号通路激活初始时，细胞内少量NF-κB/p65蛋白释放，调节相关基因转录包括上调NF-κB/p65蛋白的合成，4 h为合成高峰期。随着LPS诱导时间延长，更多的新合成的NF-κB/p65蛋白再次被释放入核，4 h核转位低于2 h高峰期，已呈现p65出核趋势，体现了NF-κB/p65核转位震荡规律以及通路中信号分子动态传递过程。
免疫荧光分析软件利用计算机处理荧光图像快捷简便，实现了对细胞荧光参数的相对定量分析，对于肉眼难以准确判断的荧光图像具有很好的辅助分析意义，为我们在此基础上进一步探讨研究NF-κB信号通路的下游相关基因表达的分子机制提供了可靠的实验依据。
引言
NF-κB信号通路在免疫应答、细胞存活和增殖分化等方面发挥重要调控作用，通路的激活表现在细胞内多种蛋白和酶的级联式反应以及相关基因的转录调控[1]。Rogers等[2]在研究一氧化氮对肿瘤坏死因子-α诱导(human umbilical vein endothelial cells, HUVFCs)的NF-κB信号通路的激活过程中发现NF-κB/p65蛋白核转位“震荡现象”，NF-κB/p65核转位作为调控转录的始动因素，是我们研究NF-κB信号通路的关键。免疫荧光是观察细胞内蛋白核转位较直观的实验方法[3]，但多限于主观定性判断荧光图片结果，具有自主知识产权的、个性化的荧光定量分析软件相对缺乏，结合细胞特征而研究设计的荧光分析软件可以相对定量分析免疫荧光图像中的核转位现象，协助探讨NF-κB/p65蛋白的核转位规律。本文将荧光分析软件应用到免疫荧光图像的定量及定位分析中，研究内毒素激活原代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的NF—κB信号通路的时效规律。
1 材料与方法
1.1 主要试剂材料与仪器
新生儿脐带取自于南昌大学第一附属医院妇产科正常足月新生儿，M199培养基购自HyClone公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)、0.25%胰酶购自Gibco公司；牛血清白蛋白、II型胶原酶购自索来宝公司；脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)(E.coil O55B5)购自Sigma公司；内皮细胞生长复合物(endothelial cell growth supplement, ECGs)购自BD公司；用于免疫荧光实验的兔抗NF-κB/p65抗体购自中山金桥公司；兔抗VIII相关抗体购自博士德生物；异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记的驴抗兔IgG购自Invitrogen公司；用于Western blot实验的鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体、鼠抗NF-κB/p65(A)抗体、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的山羊抗鼠IgG均购自Santa Cruz公司；化学发光试剂盒购自Pierce公司。
IX71型荧光显微镜为Olympus公司产品；垂直电泳系统及转印系统、全自动凝胶成像系统均为Bio-Rad公司产品。
所有细胞培养相关实验用品均经过去热源处理。
1.2 实验方法
1.2.1 原代分离培养HUVECs及鉴定
生理盐水冲洗脐静脉，消化液(1 :1.01%Ⅱ型胶原酶：0.25%胰酶)充盈脐静脉，于37℃消化30 min，收集消化液和冲洗液，1 200 r/min离心收集细胞，用含1%青、链霉素、100μg/ml ECGs和20% FBS的M199完全培养基重悬细胞并接种于培养瓶，置37℃、5% CO2的孵箱内培养，免疫荧光检测胞质Ⅷ因子相关抗原以鉴定内皮细胞[4-5]。
1.2.2 免疫荧光染色
细胞消化传代，种入24孔板爬片。待细胞贴壁后取均匀分布的单层细胞爬片随机分为6组，分别予LPS(1μg/mL)处理0.5、1、2、4 h；空白对照组无LPS处理；阴性对照组无LPS处理和一抗处理。各组处理后予4%多聚甲醛4℃固定爬片10 min，0.5% TritonX-100透化处理10 min，1%牛血清白蛋白37℃封闭30 min。行细胞免疫荧光染色，分别滴加一抗(兔抗NF-κB/p65单克隆抗体，1 :50稀释，阴性对照不加一抗)4℃过夜，次日取出37℃孵育1 h，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)洗涤三次后滴加二抗(FITC标记的驴抗兔IgG，1 000倍稀释)37℃孵育1 h，PBS洗涤三次，4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)复染2 min，PBS洗涤后用50%甘油封片。各组于荧光显微镜同一曝光条件(FITC曝光时间1/2.8 s，ISO 1600)下观察结果并拍照。各实验组均设三个复孔爬片。
1.2.3 免疫荧光图片收集、软件分析
该自主研发的软件是基于VC++6.0开发平台实现的具有菜单式图像界面的系统，主要功能模块包括以下四个部分，如图 1所示：①图像获取：荧光显微镜下每组随机取5张照片获取图片信息，添加图像到主程序中。②图像预处理：通过灰度化、二值化、均值滤波、膨胀和腐蚀等操作处理图像，减少图像噪声。③图像分割：提取细胞核二值图像进行距离变换，将像素点位置信息转化为灰度信息[6]，并提取出能代表各个细胞的“种子点”[7]，将种子点图与细胞二值图结合找到细胞图中各个细胞的所在位置并重构细胞距离图，最后利用“模拟浸没”的方法实现分水岭分割[8]，采用同样的分割方法进行粘连细胞核的分割，最后通过二值图像的四连通域方法，完成各细胞的标号。④参数提取：分别计算各个细胞和细胞核的面积及荧光强度，在得到的细胞荧光强度和细胞核荧光强度的基础上，计算得到细胞质的荧光强度，从而得到胞核与胞质的荧光强度比。其中，每个细胞的面积等于对应标号的总像素点个数，而细胞的荧光强度等于对应标号的像素点灰度总值除以细胞面积。同理得到细胞核的各个参数。细胞质荧光强度=(细胞荧光强度-细胞核荧光强度)/(细胞面积-细胞核面积)。
图1
免疫荧光分析软件设计模块
Figure1.
Design module of immuno-fluorescence analysis software
1.2.4 Western blot验证NF-κB/p65蛋白表达变化
原代HUVECs随机分为5组，分别予LPS(1μg/mL)处理0.5、1、2、4 h；空白对照组(0 h组)无LPS处理。分别提取各组总蛋白和胞质、胞核蛋白，于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至硝酸纤维膜上，室温下5 %牛奶封闭1 h，加入鼠抗NF-κB/p65(A)抗体(一抗，稀释比为1 :250)和HRP标记山羊抗鼠IgG(二抗，稀释比1 :2 000)，内参为鼠抗GAPDH抗体(稀释比为1 :500)。一抗加入后于4℃孵育过夜。洗涤后加入相应的二抗室温孵育2 h。洗涤后应用化学发光液于全自动凝胶成像系统检测杂交信号，Image J 1.44p软件定量分析比较条带结果。
1.3 统计学处理
数据采用SPSS 17.0软件分析, 用
2 实验结果分析
2.1 HUVECs形态与鉴定
原代HUVECs生长呈典型铺路石样排列[见图 2(a)]，Ⅷ因子相关抗原鉴定[见图 2(b)]阳性，与阴性对照组[见图 2(c)]相比，原代HUVECs细胞质中可见高强度的绿色荧光，胞核内荧光极弱。
图2
原代HUVECs的细胞形态与分离鉴定
(a)光镜下原代HUVECs形态；(b)荧光显微镜下Ⅷ因子鉴定内皮细胞；(c)阴性对照
Figure2. Morphology and identification of primary HUVECs(a) morphology of primary HUVECs under light microscope; (b) primary HUVECs identification with factorⅧunder fluorescence microscope; (c) negative control
2.2 免疫荧光染色法检测LPS诱导HUVECs的核因子-κB激活
如图 3所示，荧光镜下HUVECs于爬片上多聚团生长，每张爬片在荧光显微镜(40×)下随机选取5个不重叠视野观察，结果提示：与空白对照组相比，LPS各组随刺激时间增加整体荧光强度逐渐增加，胞核内荧光逐渐聚集，整体荧光强度于4 h达高峰，核转位现象在2 h组和4 h组较显著。而在未添加NF-κB/p65(A)一抗的阴性对照组中未见FITC绿色荧光，可排除二抗非特异性结合对实验的干扰。
图3
荧光显微镜下观察LPS刺激原代HUVECs后NF-κB/p65蛋白在细胞中的表达和定位
Figure3.
Localization and expression of NF-κB/p65 in HUVECs stimulated with LPS observed under fluorescence microscope
2.3 免疫荧光软件分析荧光图像检测NF-κB/p65蛋白的核转位现象
如表 1所示，LPS刺激后各组总荧光强度逐渐增强，4 h组总荧光值最高，1 h、2 h和4 h组总荧光值与空白对照组相比均有显著差异(P＜0.01)；胞核/胞质荧光比值2 h组最高，与空白对照组相比具有显著性差异(P＜0.01)。
表1
免疫荧光分析软件检测荧光值结果
Table1.
Fluorescence value of each group determined by fluorescence analysis software
2.4 Western blot检验NF-κB/p65蛋白表达变化
如图 4(a)所示，与空白对照组(0 h组)相比，总NF-κB/p65蛋白随着LPS刺激时间延长表达逐渐升高，4 h为表达高峰；胞核、胞质NF-κB/p65蛋白表达也随LPS刺激时间延长逐渐增加。图 5(b)的Image J分析结果显示：总蛋白表达上调，1 h和4 h与空白对照组相比具有显著性差异(P＜0.01)，胞质、胞核蛋白条带比照其各自对应内参后，胞核/胞质比值于2 h组明显高于空白对照组，且具有显著性差异(P＜0.01)。
图4
LPS刺激HUVECs后NF-κB/p65蛋白的表达变化
(a) Western blot检测各组NF-κB/p65蛋白的表达；(b)Image J软件分析Western blot实验结果(* *各实验组0.5 h组、1 h组、2 h组、4 h组分别与空白对照组0 h组比较,
(a) expression of NF-κB/p65 detected by Western blot; (b) results of Western blot analyzed by Image J (* *group 0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h compared with group 0 h respectively,
3 讨论与结论
免疫荧光是观察细胞内蛋白核转位现象最直观的方法，但主要通过主观定性判断荧光结果，难以量化分析。既往有电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)半定量方法检测NF-κB核转位，但实验步骤繁多复杂，需要使用放射性同位素及大量细胞，因此分析原代细胞显得尤为困难[9-11]。也有研究应用激光共聚焦显微镜定量分析细胞内目标荧光蛋白变化[12]，但鉴于实验条件的限制，我们希望在运用现有普通荧光显微镜的基础上，寻求科学的图像分析软件，为免疫荧光的定量分析提供更可靠的依据。目前市场上图像分析软件颇多：有关研究运用MetaMorph软件计算荧光素标记的p65蛋白的总荧光密度值的分布，并结合NF-κB活性试剂盒辅助分析核转位特征[2]，事实上NF-κB活性试剂盒即是EMSA和酶联免疫原理的结合，但其实验成本高且无法同时分析胞质与胞核蛋白表达关系；Noursadeghi等[13]的研究中运用Image J定量分析巨噬细胞荧光图片，但巨噬细胞多分散单个分布，而HUVECs常呈铺路石样紧密排列生长，准确分割成片细胞图像存在困难；此外，也有相关研究结合应用软件Simple PCI、Imagepro-Plus 6.0和Image J半定量分析细胞骨架蛋白免疫荧光图像，成功分割提取单个细胞[14]，通过比较细胞骨架分形维数观察微管蛋白表达变化，但多软件图像处理过程相对复杂，且参数的选取直接影响实验结果，所以对于难以分割的成片HUVECs荧光图像，胞质胞核参数的独立提取和定位还难以实现。
因此我们尝试设计VC++6.0为平台的免疫荧光分析软件，考虑HUVECs的生长特性采用基于“种子点”优化的分水岭分割算法，实现成片生长的细胞的有效分离；同时通过胞核DAPI蓝色荧光较精确定位胞核位置，以实现对图片中细胞个数、面积、圆度因子、灰度均值、荧光强度等参数的独立提取，通过上述方法得到的细胞总荧光值和胞核胞质荧光比值，进一步判断HUVECs中NF-κB/p65蛋白的表达变化和核转位现象的发生特点。
然而，由于该软件细胞分割模块是基于对应的细胞核图像，而即便是激光共聚焦显微镜下获取的荧光图像中仍存在细胞核图像荧光亮度不均匀的问题，在进行OTSU(最大熵阈值分割法)阈值处理的时候，因部分细胞核灰度值较低，当其低于自适应阈值时，会被认为是背景不被识别而出现部分细胞的漏割现象。目前还没有完成适用于将所有细胞图像都完全分割的技术，我们的研究结果显示个别低染细胞漏处理在一定程度上不会影响对整体荧光趋势的判断，同时我们的软件也在进一步完善中，通过合理化阈值尽可能识别并分割所有细胞。
本实验以LPS刺激原代HUVECs，尝试运用自主研发的免疫荧光分析软件探讨NF-κB/p65核转位规律。NF-κB作为细胞内广泛存在转录因子，可与抑制因子IκB结合成三聚体以失活的状态存在于细胞质中，当细胞受到各种因素刺激时，可激活IκB激酶与NF-κB/p65蛋白解离，活化的NF-κB/p65被释放并进入细胞核中激活转录，参与多种基因的调控[15-16]。上述实验分析显示：荧光镜下主观判断、荧光分析软件检测以及Western blot实验三种结果表现出较好的一致性，即各LPS组细胞NF-κB/p65总蛋白表达上调，于4 h表达水平最高，2 h出现核转高峰。NF-κB信号通路激活初始时，细胞内少量NF-κB/p65蛋白释放，调节相关基因转录包括上调NF-κB/p65蛋白的合成，4 h为合成高峰期。随着LPS诱导时间延长，更多的新合成的NF-κB/p65蛋白再次被释放入核，4 h核转位低于2 h高峰期，已呈现p65出核趋势，体现了NF-κB/p65核转位震荡规律以及通路中信号分子动态传递过程。
免疫荧光分析软件利用计算机处理荧光图像快捷简便，实现了对细胞荧光参数的相对定量分析，对于肉眼难以准确判断的荧光图像具有很好的辅助分析意义，为我们在此基础上进一步探讨研究NF-κB信号通路的下游相关基因表达的分子机制提供了可靠的实验依据。
