近视的发生发展与巩膜重塑密切相关。因此，为了有效防治近视，阐明巩膜重塑的发生机制至关重要。近年来，我国学者发现内质网应激可以通过未折叠蛋白反应中的肌醇需求蛋白-1/X盒结合蛋白-1通路调节凋亡蛋白的表达，从而参与调节缺氧状态下巩膜成纤维细胞的状态调节巩膜重塑的发生发展。与此同时，部分研究发现，通过药物及遗传学方法同时敲除内质网应激中的蛋白激酶RNA样内质网激酶和转录激活因子6，可以有效抑制眼轴的增长。这证明了内质网应激在巩膜重塑的发生发展过程中起到了重要作用。但对于内质网应激与巩膜重塑的综合分析国内外尚无报道。深入分析内质网与巩膜重塑的关联，对后续巩膜重塑机制的分析研究具有重要意义。
引用本文： 刘钊, 谢兵, 蔡善君. 内质网应激在巩膜重塑中的研究现状及进展. 中华眼底病杂志, 2023, 39(10): 873-878. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20221201-00634 复制
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近年来，近视的患病率不断上升，已成为全球的公共卫生问题[1-2]。导致近视的主要原因是眼轴长度的改变，这一过程是巩膜重塑的结果。一般认为，近视的发生发展与巩膜重塑密切相关，巩膜重塑是一个动态过程，其涉及了巩膜细胞外基质（ECM）的合成与降解[3]。为了有效干预近视的进一步发生发展，分析及阐明巩膜重塑的具体机制至关重要。已有研究证明，内质网应激（ERS）在维持细胞稳态和组织稳定性、纤维化疾病ECM重塑的发生发展以及近视相关巩膜重塑中发挥重要作用[4-6]。但对于ERS与ECM重塑的综合分析国内外尚无报道。现就ERS在巩膜重塑中的研究现状及进展作一综述，以期为后续巩膜重塑机制的分析研究提供参考。
1 巩膜重塑
巩膜是致密的纤维粘弹性结缔组织，对维持眼球的形状起着关键作用。其主要结构成分是由巩膜成纤维细胞分泌的胶原纤维，其中Ⅰ型胶原蛋白构成的胶原纤维占比最高[7]。除此之外，Ⅰ型胶原蛋白亦是巩膜ECM的主要组成成分[3]。巩膜的胚胎发育伴随着巩膜成纤维细胞的生长和繁殖、胶原等的分泌、胶原类型和含量的变化以及胶原纤维的形成等[8]。胶原蛋白形成胶原纤维，使巩膜具有很强的弹性，并保持巩膜结构和眼球的形状[9]。因此，胶原蛋白是研究巩膜重塑的关键蛋白。在近视发生过程中，巩膜是靶组织，而胶原蛋白则是所有调节机制的靶蛋白。近视发生的早期，巩膜的Ⅰ型胶原蛋白mRNA水平降低，导致Ⅰ型胶原蛋白减少、巩膜ECM成分改变，从而引起巩膜变薄、眼轴增长及眼球的形态改变[10-11]。因此，巩膜重塑的实质其实是巩膜ECM的重塑，主要包括ECM mRNA表达和巩膜生物力学性质的变化[12]。其中，胶原纤维的直径、分布和方向都会影响巩膜的生物力学特性。
目前，大量研究表明，巩膜重塑的发生与脉络膜变薄、血流减少密切相关[13]。脉络膜是巩膜血液供应的主要来源，其血流量的减少可能导致巩膜缺氧，采用单细胞测序分析技术也发现近视眼的巩膜中缺氧信号富集，由此证明近视的发生发展过程中巩膜确实存在着缺氧现象[14]。
内质网是调控细胞内蛋白质正确折叠的重要细胞器，只有适当折叠的蛋白质才能被运送到高尔基体进行进一步加工[15]。当出现蛋白质过载、折叠能力减弱或者病理性刺激如缺氧时则可能诱发ERS并激活未折叠蛋白反应（UPR）[16]。目前，已有研究表明，ERS可以在转录及翻译水平上调基质金属蛋白酶（MMP）-2的表达[17]。这与既往研究发现的缺氧可以导致MMP-2上调以及形觉剥夺性近视（FDM）小鼠模型中MMP-2表达明显升高相一致[18]。MMP-2可以降解巩膜Ⅰ型胶原蛋白，导致胶原变薄、ECM成分改变从而导致巩膜重塑并引起近视的发生[18]。这说明ERS在巩膜重塑的发生中占有重要地位。
2 ERS
内质网是真核细胞中最大的细胞器之一，其在细胞中三分之一以上蛋白质的合成、折叠和结构成熟过程中均起着重要作用[19]。当蛋白质负荷和折叠能力之间的不平衡、营养缺乏以及缺氧等刺激因素出现时，作为回应，细胞激活了ERS并表现为一种称为UPR的适应性机制[20]。UPR通过抑制蛋白质翻译、诱导内质网相关分子伴侣促进未折叠蛋白质的折叠、激活内质网相关蛋白降解系统去除未折叠蛋白质以及促进细胞存活来恢复蛋白质的动态平衡。
UPR有三个分支，由位于内质网膜上的不同的ERS传感器启动，其分别是蛋白激酶RNA （PKR）样内质网激酶（PERK）、肌醇需求酶-1（IRE1）以及转录激活因子-6（ATF6）。在生理情况下，这些蛋白质与ER伴侣蛋白即免疫球蛋白重链结合蛋白（BiP，也称为GRP78）结合，并保持无活性状态。当ERS发生时，BiP与上述三种传感器蛋白解离，并触发了UPR的三条分支[21]。UPR的三条分支均会通过蛋白质折叠需求和能力，重新调整到动态平衡，以便细胞能够继续生存和发挥功能[22]。然而，当长期慢性的ERS难以恢复内质网的正常功能时，UPR的三条分支将会通过激活CCAAT/增强子结合同源蛋白（CHOP，也称为生长停滞和DNA损伤诱导基因153），以启动促凋亡途径[23]（图1）。目前，已有研究表明，ERS可以在转录及翻译水平上调MMP-2的表达[17]，并且MMP-2在巩膜重塑的发生中占有重要地位。除此之外，2017年陈庆中[24]发现了ERS在豚鼠FDM模型中与转化生长因子（TGF）-β1交互作用从而调节巩膜重塑的发生发展。2022年唐晓兰等[25]证明了ERS可以通过调节凋亡蛋白的表达以调节巩膜重塑。与此同时，日本学者Ikeda等[6]对镜片诱导性近视（LIM）模型小鼠腹腔内注射及局部使用4-苯基丁酸抑制ERS，并与使用了磷酸盐缓冲液的模型小鼠进行对比，发现ERS被抑制后眼轴增长受到了有效的抑制。虽然尚无研究证明UPR三条分支在巩膜重塑发生中的具体变化及影响机制，但是我们仍认为，UPR是未来研究巩膜重塑发生机制的重要方向。
图1
ERS作用示意图 内质网腔内的未折叠蛋白积累，BiP与PERK、IRE1以及ATF6解离，导致UPR发生。活性IRE1通过转录因子XBP1的非常规剪接上调UPR靶基因。IRE1在ERS过程中通过降解内质网定位的mRNA转录物减少分泌蛋白的翻译，这一过程被称为RIDD。ATF6的激活导致其转运到高尔基体，在那里被蛋白水解处理。XBP1和ATF6-n上调编码内质网折叠和降解机制的基因。激活的PERK使eIF2α磷酸化，同时，eIF2α的磷酸化诱导转录因子ATF4的翻译，促进氧化折叠和氨基酸合成。此外，ATF4还可以通过上调GADD34促进正常翻译速率的恢复 ERS：内质网应激；PERK：蛋白激酶RNA样内质网激酶；BiP：免疫球蛋白重链结合蛋白；IRE1：肌醇需求酶-1；ATF：转录激活因子；UPR：折叠蛋白反应；RIDD：IRE1依赖性衰减；eIF2α：真核细胞起始因子2α；GADD34：生长阻滞和DNA损伤诱导因子34；PP1：蛋白磷酸酶-1；G-actin：G-肌动蛋白；XBP1：X盒结合蛋白-1；Bcl-2：抗凋亡蛋白；CHOP：CCAAT/增强子结合同源蛋白
2.1 IRE1-X盒结合蛋白-1（XBP1）通路
IRE1是UPR最保守的信号转导分子之一，它是一种位于内质网膜上的丝氨酸/苏氨酸激酶，参与维持内质网稳态[26]。当ERS发生时，与BiP解离的活性IRE1催化XBP1 mRNA中26个核苷酸内含子的切除，导致密码子阅读框架的改变并产生一种活性稳定的转录因子XBP1[27-28]。XBP1是一种特殊的转录因子，可以激活广泛的UPR靶基因的表达，这些基因涉及蛋白质折叠（伴侣和折叠酶）、蛋白质进入内质网、蛋白质质量控制以及其他调节糖基化和内质网相关降解的因素[29-30]。除了以上述方式减少关键的蛋白质折叠成分外，IRE1的核糖核酸酶还通过调节IRE1依赖性衰变（RIDD）来调节mRNA和microRNA的稳定性[31-32]。这是一种保守的机制，通过降解mRNA来减少内质网内的蛋白质负荷，从而维持内质网稳态的动态平衡。此外，RIDD还参与各种细胞过程的调节，包括细胞死亡和炎症反应[33]。最后，持续的IRE1刺激会激活凋亡信号调节激酶1（A-SK1）致使下游的c-jun氨基末端激酶（JNK）磷酸化[34]，并在ERS未停止的情况下促进细胞凋亡。据报道，磷酸化的JNK既能促进促凋亡基因（Bax）的表达，又能抑制抗凋亡基因（Bcl-2）的表达 [30]。Bcl-2家族不仅包含了促凋亡基因同时也含有抗凋亡基因，其通过调节线粒体膜外膜的完整性来调控这种包括ERS在内的“内在”的凋亡途径。既往研究发现了IRE1在脂肪和胆固醇生物生成、肝脏药物解毒、肠道炎症、免疫细胞分化和活动、胰腺功能（内分泌和外分泌功能）和脑生理等方面的作用[35]。这说明IRE1在全身器官保持动态平衡的过程中起到了重要作用。但是，关于IRE1与巩膜重塑之间的联系罕有报道。2022年唐晓兰等[25]利用体外培养的人胚胎眼巩膜成纤维细胞，模拟近视巩膜缺氧环境，发现缺氧可以导致IRE1表达上调，同时其磷酸化-IRE1水平也随缺氧时间延长逐渐升高，且随着缺氧时间的延长，细胞凋亡率逐渐增加。这证明了缺氧可以诱发ERS，长时间的ERS通过持续激活IRE1的磷酸激酶活性，致使JNK磷酸化激活。该研究同时发现了在缺氧条件下Bcl-2表达下调、Bax表达明显上调以及成纤维细胞转分化标志物表达升高，进一步证明缺氧激活了ERS反应并参与调节缺氧状态下巩膜成纤维细胞的状态（图2）。
图2
IRE1通路示意图 长时间的内质网应激通过持续激活IRE1的磷酸激酶活性，致使JNK磷酸化激活，从而促进抗凋亡基因Bcl-2表达下调、促凋亡基因Bax表达明显上调并参与促进巩膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞导致巩膜重塑 IRE1：肌醇需求酶-1；BiP：免疫球蛋白重链结合蛋白；JNK：c-jun氨基末端激酶；Bcl-2：抗凋亡蛋白；Bax：促凋亡蛋白
IRE1-XBP1通路作为UPR通路之一，其可以通过激活A-SK1并导致下游的JNK磷酸化来诱导细胞凋亡。并且，根据既往研究报道，该通路参与了缺氧条件下的巩膜重塑。目前，国内外对于该通路在巩膜重塑发生发展的具体分析研究较少，但可以确定的是，该通路的确参与了巩膜重塑。既往研究在抑制了LIM模型中的IRE1通路后并未发现巩膜重塑受到明显影响。因此，我们认为，后续研究可以通过观察LRE1抑制或敲除后的FDM及LIM模型中巩膜重塑的发生发展，以判断LRE1通路在巩膜重塑的发生中所起到的具体作用，并借此寻找预防近视药物的新方向及新靶点。虽然尚不确定IRE1激活的其他因子在巩膜重塑发生过程中起到的作用，但IRE1依旧是值得关注的近视预防的新方向之一。
2.2 PERK-eIF2α-ATF4通路
PERK同样是一种位于内质网膜的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶，其腔结构域与IRE1同源，因此两者有着相似的激活机制[36]。当ERS发生时，PERK与BiP解离并通过其反式自动磷酸化增加eIF2的α亚单位的酶活性同时引导其磷酸化[37]，导致eIF2α活性降低，从而减缓蛋白质翻译，给细胞充分的时间来尝试折叠已存在于内质网管腔中的蛋白质[38]。这种现象被称为整合应激反应[39]。与此同时，PERK同样可以通过激活ATF4来终止整合应激反应从而恢复正常的翻译[5]。内质网通过以上方式减弱ERS，从而减少了错误折叠的蛋白质数量，导致UPR信号减弱，使得细胞存活。尽管eIF2α磷酸化导致的蛋白质翻译暂停对处于ERS下的细胞是有益的，但是，PERK的过度激活则会导致ATF4的激活，并上调CHOP的表达以抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达，同时增强促凋亡基因Bax的表达，最后导致细胞死亡[40]。近年来，部分研究发现了PERK-eIF2α-ATF4通路通过对MMP-2转录和翻译调节来影响浅层绒毛外滋养细胞侵袭的发生发展[17]。同时，Ren等[41]发现了缺氧诱导因子-1α亦通过影响MMP-2的表达来改变ECM成分以促进巩膜重塑，最终导致近视。最近，Ikeda等[6]通过药物和遗传方法抑制或敲除PERK发现，当PERK及ATF6同时受到抑制时，LIM模型中巩膜重塑会受到抑制；除此之外，研究者对小鼠眼球局部用药促进eIF2α磷酸化1周后，小鼠眼球出现了近视表现。这证明了LIM模型中ERK-eIF2α-ATF4通路参与了巩膜重塑的调节 （图3）。
图3
PERK通路示意图 PERK-eIF2α-ATF4通路通过对MMP-2的转录和翻译进行调节，而MMP-2通过调节ECM成分改变促进巩膜重塑；但目前尚无研究证明PERK-eIF2α-ATF4是否可以通过影响MMP-2导致巩膜重塑 PERK：蛋白激酶RNA样内质网激酶；BiP：免疫球蛋白重链结合蛋白；eIF-2：翻译起始因子-2；ATF-4：转录激活因子4；CHOP：CCAAT/增强子结合同源蛋白；Bcl-2：抗凋亡蛋白；Bax：促凋亡蛋白；MMP-2：基质金属蛋白酶-2；ECM：细胞外基质
虽然尚不明确PERK通路是否通过影响MMP-2来诱发LIM相关巩膜重塑，但根据既往研究，PERK抑制剂可有效抑制LIM导致的眼轴延长[6]。这说明该通路的研究对于未来LIM发生机制的分析及LIM的防治具有重要价值。除此之外，国内外尚无研究对FDM模型中PERK与巩膜重塑的关系，因此，观察PERK抑制或敲除后的FDM模型中巩膜重塑的变化同样是可行的研究方向。
2.3 ATF6通路
ATF6是一种内质网跨膜蛋白，目前对其的了解是最少的。它包括了一个潜在的N-末端转录因子、一个跨膜区和一个内质网定位的C-末端结构域[42]。当内质网内蓄积大量错误折叠蛋白质时，ERS导致相对分子质量为90×103的ATF6反转录体从内质网运输到高尔基体。在高尔基体中，位点1和位点2的蛋白酶顺序切割释放N-末端结构域，从而产生了释放出具有活性的相对分子质量为50×103的n端片段ATF6-n，并作为激活因子去激活细胞核内的靶基因[43]，如XBP1及CHOP[44]。有趣的是，ATF6-n通过形成异二聚体与XBP1表现出串扰，这可能会驱动特定的基因表达程序，从而扩大内质网大小并增加其蛋白质折叠能力[45]。 已有研究发现，ATF6通过与侏儒相关转录因子（Runx2）结合促进肥大软骨细胞分化，从而促进软骨内骨的纵向生长（图4），其中Runx2是成骨细胞分化和肥大软骨细胞形成的重要中枢调节因子[46]。软骨的纵向及轴向延长模式与巩膜的轴向延长模式类似，但是否依赖同一种方式诱导尚不明确。Ikeda等[6]在通过药物抑制了ATF6位点2蛋白酶的表达后，发现巩膜重塑受到了明显抑制；同时，其利用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9系统敲除了LIM模型中的ATF6，发现眼轴的增长同样受到了抑制；并且，同时敲除ATF6及PERK同样可以抑制眼轴的增长。因此，可以认为ATF6与PERK联合作用控制眼轴的增长，且ATF6可能占据主要地位。
图4
ATF6通路示意图 ATF6和Runx2可以在软骨细胞分化过程中形成蛋白质复合体，然后ATF6的过表达可以促进胶原X和MMP-13的表达，进而促进依赖Runx2的肥大软骨细胞分化。目前尚不明确ATF6是否可以通过相同方式影响巩膜组织 ATF6：转录激活因子-6；BiP：免疫球蛋白重链结合蛋白；MMP-13：基质金属蛋白酶-13；Runx2：侏儒相关转录因子
虽然尚不明确ATF6通路在LIM模型中调节眼轴长度的具体方式。但是，结合既往研究，我们认为与软骨内骨成长类似，ATF6通路可能通过与Runx2结合以促进眼轴长度的改变。虽然，目前尚无研究全面分析ATF6在巩膜重塑发生发展中的作用，但ATF6通路仍是未来研究巩膜重塑基质的重要方向。
ERS通过激活IRE1-XBP1、PERK-eIF2α-ATF4及ATF6通路以维持蛋白质折叠的动态平衡。研究发现，MMP-2通过调节ECM的合成与降解导致巩膜重塑的发生，是巩膜重塑机制的热点研究对象之一[47]。该蛋白是MMP作为前体酶原合成的，其折叠发生在内质网内[48]。因此，内质网的调控对于MMP-2的正确折叠至关重要。Lee等[17]已经报道了PERK-eIF2α-ATF4通路对MMP-2转录和翻译调节作用。因此，我们仍认为，PERK-eIF2α-ATF4通路在巩膜重塑的发生及发展中占有一席之地。因为PERK与IRE1具有相同腔结构域[36]，我们猜想与PERK有着相同激活机制的IRE1可能存在通过影响MMP-2的转录及翻译来影响巩膜重塑的机制，所以研究并分析PERK-eIF2α-ATF4通路及IRE1-XBP1通路在调控MMP-2的表达中的贡献，对于之后分析及研究巩膜重塑干预靶点具有重要价值。除此之外，唐晓兰等[25]发现，IRE1-XBP1通路可以通过调节CHOP的激活来控制Bcl-2表达下调以及Bax表达上调，并通过此方式调控巩膜成纤维细胞的功能。已有文献指出，IRE1-XBP1、PERK-eIF2α-ATF4及ATF6通路均可调节CHOP的激活[24]。虽然目前尚无研究证明三条通路均可通过调节CHOP的激活来调控巩膜成纤维细胞的功能以及三者在此过程中发挥的作用大小，但是，既往研究结果提示这应是未来研究巩膜重塑发生发展的重要方向。与此同时，目前对于ATF6通路的研究报道虽然较少，但是考虑到其在骨组织中的重要作用，该通路亦应是是未来分析及阐述巩膜重塑机制的重要切入点。
3 总结与展望
ERS作为调控细胞内蛋白质折叠的细胞器，其对细胞稳定性的作用不言而喻。目前，国内外众多研究发现了ERS中的三条通路与近视相关巩膜重塑有着千丝万缕的联系。我们认为这三条通路对于日后分析及研究巩膜重塑机制及巩膜重塑的干预手段具有价值。随着大数据时代的到来，数字化分析及信息共享为科研工作者提供了极大的便利，通过将大数据与LIM及FDM模型相结合的方式，未来对于巩膜重塑的研究将会有更广阔的空间。
近年来，近视的患病率不断上升，已成为全球的公共卫生问题[1-2]。导致近视的主要原因是眼轴长度的改变，这一过程是巩膜重塑的结果。一般认为，近视的发生发展与巩膜重塑密切相关，巩膜重塑是一个动态过程，其涉及了巩膜细胞外基质（ECM）的合成与降解[3]。为了有效干预近视的进一步发生发展，分析及阐明巩膜重塑的具体机制至关重要。已有研究证明，内质网应激（ERS）在维持细胞稳态和组织稳定性、纤维化疾病ECM重塑的发生发展以及近视相关巩膜重塑中发挥重要作用[4-6]。但对于ERS与ECM重塑的综合分析国内外尚无报道。现就ERS在巩膜重塑中的研究现状及进展作一综述，以期为后续巩膜重塑机制的分析研究提供参考。
1 巩膜重塑
巩膜是致密的纤维粘弹性结缔组织，对维持眼球的形状起着关键作用。其主要结构成分是由巩膜成纤维细胞分泌的胶原纤维，其中Ⅰ型胶原蛋白构成的胶原纤维占比最高[7]。除此之外，Ⅰ型胶原蛋白亦是巩膜ECM的主要组成成分[3]。巩膜的胚胎发育伴随着巩膜成纤维细胞的生长和繁殖、胶原等的分泌、胶原类型和含量的变化以及胶原纤维的形成等[8]。胶原蛋白形成胶原纤维，使巩膜具有很强的弹性，并保持巩膜结构和眼球的形状[9]。因此，胶原蛋白是研究巩膜重塑的关键蛋白。在近视发生过程中，巩膜是靶组织，而胶原蛋白则是所有调节机制的靶蛋白。近视发生的早期，巩膜的Ⅰ型胶原蛋白mRNA水平降低，导致Ⅰ型胶原蛋白减少、巩膜ECM成分改变，从而引起巩膜变薄、眼轴增长及眼球的形态改变[10-11]。因此，巩膜重塑的实质其实是巩膜ECM的重塑，主要包括ECM mRNA表达和巩膜生物力学性质的变化[12]。其中，胶原纤维的直径、分布和方向都会影响巩膜的生物力学特性。
目前，大量研究表明，巩膜重塑的发生与脉络膜变薄、血流减少密切相关[13]。脉络膜是巩膜血液供应的主要来源，其血流量的减少可能导致巩膜缺氧，采用单细胞测序分析技术也发现近视眼的巩膜中缺氧信号富集，由此证明近视的发生发展过程中巩膜确实存在着缺氧现象[14]。
内质网是调控细胞内蛋白质正确折叠的重要细胞器，只有适当折叠的蛋白质才能被运送到高尔基体进行进一步加工[15]。当出现蛋白质过载、折叠能力减弱或者病理性刺激如缺氧时则可能诱发ERS并激活未折叠蛋白反应（UPR）[16]。目前，已有研究表明，ERS可以在转录及翻译水平上调基质金属蛋白酶（MMP）-2的表达[17]。这与既往研究发现的缺氧可以导致MMP-2上调以及形觉剥夺性近视（FDM）小鼠模型中MMP-2表达明显升高相一致[18]。MMP-2可以降解巩膜Ⅰ型胶原蛋白，导致胶原变薄、ECM成分改变从而导致巩膜重塑并引起近视的发生[18]。这说明ERS在巩膜重塑的发生中占有重要地位。
2 ERS
内质网是真核细胞中最大的细胞器之一，其在细胞中三分之一以上蛋白质的合成、折叠和结构成熟过程中均起着重要作用[19]。当蛋白质负荷和折叠能力之间的不平衡、营养缺乏以及缺氧等刺激因素出现时，作为回应，细胞激活了ERS并表现为一种称为UPR的适应性机制[20]。UPR通过抑制蛋白质翻译、诱导内质网相关分子伴侣促进未折叠蛋白质的折叠、激活内质网相关蛋白降解系统去除未折叠蛋白质以及促进细胞存活来恢复蛋白质的动态平衡。
UPR有三个分支，由位于内质网膜上的不同的ERS传感器启动，其分别是蛋白激酶RNA （PKR）样内质网激酶（PERK）、肌醇需求酶-1（IRE1）以及转录激活因子-6（ATF6）。在生理情况下，这些蛋白质与ER伴侣蛋白即免疫球蛋白重链结合蛋白（BiP，也称为GRP78）结合，并保持无活性状态。当ERS发生时，BiP与上述三种传感器蛋白解离，并触发了UPR的三条分支[21]。UPR的三条分支均会通过蛋白质折叠需求和能力，重新调整到动态平衡，以便细胞能够继续生存和发挥功能[22]。然而，当长期慢性的ERS难以恢复内质网的正常功能时，UPR的三条分支将会通过激活CCAAT/增强子结合同源蛋白（CHOP，也称为生长停滞和DNA损伤诱导基因153），以启动促凋亡途径[23]（图1）。目前，已有研究表明，ERS可以在转录及翻译水平上调MMP-2的表达[17]，并且MMP-2在巩膜重塑的发生中占有重要地位。除此之外，2017年陈庆中[24]发现了ERS在豚鼠FDM模型中与转化生长因子（TGF）-β1交互作用从而调节巩膜重塑的发生发展。2022年唐晓兰等[25]证明了ERS可以通过调节凋亡蛋白的表达以调节巩膜重塑。与此同时，日本学者Ikeda等[6]对镜片诱导性近视（LIM）模型小鼠腹腔内注射及局部使用4-苯基丁酸抑制ERS，并与使用了磷酸盐缓冲液的模型小鼠进行对比，发现ERS被抑制后眼轴增长受到了有效的抑制。虽然尚无研究证明UPR三条分支在巩膜重塑发生中的具体变化及影响机制，但是我们仍认为，UPR是未来研究巩膜重塑发生机制的重要方向。
图1
ERS作用示意图 内质网腔内的未折叠蛋白积累，BiP与PERK、IRE1以及ATF6解离，导致UPR发生。活性IRE1通过转录因子XBP1的非常规剪接上调UPR靶基因。IRE1在ERS过程中通过降解内质网定位的mRNA转录物减少分泌蛋白的翻译，这一过程被称为RIDD。ATF6的激活导致其转运到高尔基体，在那里被蛋白水解处理。XBP1和ATF6-n上调编码内质网折叠和降解机制的基因。激活的PERK使eIF2α磷酸化，同时，eIF2α的磷酸化诱导转录因子ATF4的翻译，促进氧化折叠和氨基酸合成。此外，ATF4还可以通过上调GADD34促进正常翻译速率的恢复 ERS：内质网应激；PERK：蛋白激酶RNA样内质网激酶；BiP：免疫球蛋白重链结合蛋白；IRE1：肌醇需求酶-1；ATF：转录激活因子；UPR：折叠蛋白反应；RIDD：IRE1依赖性衰减；eIF2α：真核细胞起始因子2α；GADD34：生长阻滞和DNA损伤诱导因子34；PP1：蛋白磷酸酶-1；G-actin：G-肌动蛋白；XBP1：X盒结合蛋白-1；Bcl-2：抗凋亡蛋白；CHOP：CCAAT/增强子结合同源蛋白
2.1 IRE1-X盒结合蛋白-1（XBP1）通路
IRE1是UPR最保守的信号转导分子之一，它是一种位于内质网膜上的丝氨酸/苏氨酸激酶，参与维持内质网稳态[26]。当ERS发生时，与BiP解离的活性IRE1催化XBP1 mRNA中26个核苷酸内含子的切除，导致密码子阅读框架的改变并产生一种活性稳定的转录因子XBP1[27-28]。XBP1是一种特殊的转录因子，可以激活广泛的UPR靶基因的表达，这些基因涉及蛋白质折叠（伴侣和折叠酶）、蛋白质进入内质网、蛋白质质量控制以及其他调节糖基化和内质网相关降解的因素[29-30]。除了以上述方式减少关键的蛋白质折叠成分外，IRE1的核糖核酸酶还通过调节IRE1依赖性衰变（RIDD）来调节mRNA和microRNA的稳定性[31-32]。这是一种保守的机制，通过降解mRNA来减少内质网内的蛋白质负荷，从而维持内质网稳态的动态平衡。此外，RIDD还参与各种细胞过程的调节，包括细胞死亡和炎症反应[33]。最后，持续的IRE1刺激会激活凋亡信号调节激酶1（A-SK1）致使下游的c-jun氨基末端激酶（JNK）磷酸化[34]，并在ERS未停止的情况下促进细胞凋亡。据报道，磷酸化的JNK既能促进促凋亡基因（Bax）的表达，又能抑制抗凋亡基因（Bcl-2）的表达 [30]。Bcl-2家族不仅包含了促凋亡基因同时也含有抗凋亡基因，其通过调节线粒体膜外膜的完整性来调控这种包括ERS在内的“内在”的凋亡途径。既往研究发现了IRE1在脂肪和胆固醇生物生成、肝脏药物解毒、肠道炎症、免疫细胞分化和活动、胰腺功能（内分泌和外分泌功能）和脑生理等方面的作用[35]。这说明IRE1在全身器官保持动态平衡的过程中起到了重要作用。但是，关于IRE1与巩膜重塑之间的联系罕有报道。2022年唐晓兰等[25]利用体外培养的人胚胎眼巩膜成纤维细胞，模拟近视巩膜缺氧环境，发现缺氧可以导致IRE1表达上调，同时其磷酸化-IRE1水平也随缺氧时间延长逐渐升高，且随着缺氧时间的延长，细胞凋亡率逐渐增加。这证明了缺氧可以诱发ERS，长时间的ERS通过持续激活IRE1的磷酸激酶活性，致使JNK磷酸化激活。该研究同时发现了在缺氧条件下Bcl-2表达下调、Bax表达明显上调以及成纤维细胞转分化标志物表达升高，进一步证明缺氧激活了ERS反应并参与调节缺氧状态下巩膜成纤维细胞的状态（图2）。
图2
IRE1通路示意图 长时间的内质网应激通过持续激活IRE1的磷酸激酶活性，致使JNK磷酸化激活，从而促进抗凋亡基因Bcl-2表达下调、促凋亡基因Bax表达明显上调并参与促进巩膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞导致巩膜重塑 IRE1：肌醇需求酶-1；BiP：免疫球蛋白重链结合蛋白；JNK：c-jun氨基末端激酶；Bcl-2：抗凋亡蛋白；Bax：促凋亡蛋白
IRE1-XBP1通路作为UPR通路之一，其可以通过激活A-SK1并导致下游的JNK磷酸化来诱导细胞凋亡。并且，根据既往研究报道，该通路参与了缺氧条件下的巩膜重塑。目前，国内外对于该通路在巩膜重塑发生发展的具体分析研究较少，但可以确定的是，该通路的确参与了巩膜重塑。既往研究在抑制了LIM模型中的IRE1通路后并未发现巩膜重塑受到明显影响。因此，我们认为，后续研究可以通过观察LRE1抑制或敲除后的FDM及LIM模型中巩膜重塑的发生发展，以判断LRE1通路在巩膜重塑的发生中所起到的具体作用，并借此寻找预防近视药物的新方向及新靶点。虽然尚不确定IRE1激活的其他因子在巩膜重塑发生过程中起到的作用，但IRE1依旧是值得关注的近视预防的新方向之一。
2.2 PERK-eIF2α-ATF4通路
PERK同样是一种位于内质网膜的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶，其腔结构域与IRE1同源，因此两者有着相似的激活机制[36]。当ERS发生时，PERK与BiP解离并通过其反式自动磷酸化增加eIF2的α亚单位的酶活性同时引导其磷酸化[37]，导致eIF2α活性降低，从而减缓蛋白质翻译，给细胞充分的时间来尝试折叠已存在于内质网管腔中的蛋白质[38]。这种现象被称为整合应激反应[39]。与此同时，PERK同样可以通过激活ATF4来终止整合应激反应从而恢复正常的翻译[5]。内质网通过以上方式减弱ERS，从而减少了错误折叠的蛋白质数量，导致UPR信号减弱，使得细胞存活。尽管eIF2α磷酸化导致的蛋白质翻译暂停对处于ERS下的细胞是有益的，但是，PERK的过度激活则会导致ATF4的激活，并上调CHOP的表达以抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达，同时增强促凋亡基因Bax的表达，最后导致细胞死亡[40]。近年来，部分研究发现了PERK-eIF2α-ATF4通路通过对MMP-2转录和翻译调节来影响浅层绒毛外滋养细胞侵袭的发生发展[17]。同时，Ren等[41]发现了缺氧诱导因子-1α亦通过影响MMP-2的表达来改变ECM成分以促进巩膜重塑，最终导致近视。最近，Ikeda等[6]通过药物和遗传方法抑制或敲除PERK发现，当PERK及ATF6同时受到抑制时，LIM模型中巩膜重塑会受到抑制；除此之外，研究者对小鼠眼球局部用药促进eIF2α磷酸化1周后，小鼠眼球出现了近视表现。这证明了LIM模型中ERK-eIF2α-ATF4通路参与了巩膜重塑的调节 （图3）。
图3
PERK通路示意图 PERK-eIF2α-ATF4通路通过对MMP-2的转录和翻译进行调节，而MMP-2通过调节ECM成分改变促进巩膜重塑；但目前尚无研究证明PERK-eIF2α-ATF4是否可以通过影响MMP-2导致巩膜重塑 PERK：蛋白激酶RNA样内质网激酶；BiP：免疫球蛋白重链结合蛋白；eIF-2：翻译起始因子-2；ATF-4：转录激活因子4；CHOP：CCAAT/增强子结合同源蛋白；Bcl-2：抗凋亡蛋白；Bax：促凋亡蛋白；MMP-2：基质金属蛋白酶-2；ECM：细胞外基质
虽然尚不明确PERK通路是否通过影响MMP-2来诱发LIM相关巩膜重塑，但根据既往研究，PERK抑制剂可有效抑制LIM导致的眼轴延长[6]。这说明该通路的研究对于未来LIM发生机制的分析及LIM的防治具有重要价值。除此之外，国内外尚无研究对FDM模型中PERK与巩膜重塑的关系，因此，观察PERK抑制或敲除后的FDM模型中巩膜重塑的变化同样是可行的研究方向。
2.3 ATF6通路
ATF6是一种内质网跨膜蛋白，目前对其的了解是最少的。它包括了一个潜在的N-末端转录因子、一个跨膜区和一个内质网定位的C-末端结构域[42]。当内质网内蓄积大量错误折叠蛋白质时，ERS导致相对分子质量为90×103的ATF6反转录体从内质网运输到高尔基体。在高尔基体中，位点1和位点2的蛋白酶顺序切割释放N-末端结构域，从而产生了释放出具有活性的相对分子质量为50×103的n端片段ATF6-n，并作为激活因子去激活细胞核内的靶基因[43]，如XBP1及CHOP[44]。有趣的是，ATF6-n通过形成异二聚体与XBP1表现出串扰，这可能会驱动特定的基因表达程序，从而扩大内质网大小并增加其蛋白质折叠能力[45]。 已有研究发现，ATF6通过与侏儒相关转录因子（Runx2）结合促进肥大软骨细胞分化，从而促进软骨内骨的纵向生长（图4），其中Runx2是成骨细胞分化和肥大软骨细胞形成的重要中枢调节因子[46]。软骨的纵向及轴向延长模式与巩膜的轴向延长模式类似，但是否依赖同一种方式诱导尚不明确。Ikeda等[6]在通过药物抑制了ATF6位点2蛋白酶的表达后，发现巩膜重塑受到了明显抑制；同时，其利用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9系统敲除了LIM模型中的ATF6，发现眼轴的增长同样受到了抑制；并且，同时敲除ATF6及PERK同样可以抑制眼轴的增长。因此，可以认为ATF6与PERK联合作用控制眼轴的增长，且ATF6可能占据主要地位。
图4
ATF6通路示意图 ATF6和Runx2可以在软骨细胞分化过程中形成蛋白质复合体，然后ATF6的过表达可以促进胶原X和MMP-13的表达，进而促进依赖Runx2的肥大软骨细胞分化。目前尚不明确ATF6是否可以通过相同方式影响巩膜组织 ATF6：转录激活因子-6；BiP：免疫球蛋白重链结合蛋白；MMP-13：基质金属蛋白酶-13；Runx2：侏儒相关转录因子
虽然尚不明确ATF6通路在LIM模型中调节眼轴长度的具体方式。但是，结合既往研究，我们认为与软骨内骨成长类似，ATF6通路可能通过与Runx2结合以促进眼轴长度的改变。虽然，目前尚无研究全面分析ATF6在巩膜重塑发生发展中的作用，但ATF6通路仍是未来研究巩膜重塑基质的重要方向。
ERS通过激活IRE1-XBP1、PERK-eIF2α-ATF4及ATF6通路以维持蛋白质折叠的动态平衡。研究发现，MMP-2通过调节ECM的合成与降解导致巩膜重塑的发生，是巩膜重塑机制的热点研究对象之一[47]。该蛋白是MMP作为前体酶原合成的，其折叠发生在内质网内[48]。因此，内质网的调控对于MMP-2的正确折叠至关重要。Lee等[17]已经报道了PERK-eIF2α-ATF4通路对MMP-2转录和翻译调节作用。因此，我们仍认为，PERK-eIF2α-ATF4通路在巩膜重塑的发生及发展中占有一席之地。因为PERK与IRE1具有相同腔结构域[36]，我们猜想与PERK有着相同激活机制的IRE1可能存在通过影响MMP-2的转录及翻译来影响巩膜重塑的机制，所以研究并分析PERK-eIF2α-ATF4通路及IRE1-XBP1通路在调控MMP-2的表达中的贡献，对于之后分析及研究巩膜重塑干预靶点具有重要价值。除此之外，唐晓兰等[25]发现，IRE1-XBP1通路可以通过调节CHOP的激活来控制Bcl-2表达下调以及Bax表达上调，并通过此方式调控巩膜成纤维细胞的功能。已有文献指出，IRE1-XBP1、PERK-eIF2α-ATF4及ATF6通路均可调节CHOP的激活[24]。虽然目前尚无研究证明三条通路均可通过调节CHOP的激活来调控巩膜成纤维细胞的功能以及三者在此过程中发挥的作用大小，但是，既往研究结果提示这应是未来研究巩膜重塑发生发展的重要方向。与此同时，目前对于ATF6通路的研究报道虽然较少，但是考虑到其在骨组织中的重要作用，该通路亦应是是未来分析及阐述巩膜重塑机制的重要切入点。
3 总结与展望
ERS作为调控细胞内蛋白质折叠的细胞器，其对细胞稳定性的作用不言而喻。目前，国内外众多研究发现了ERS中的三条通路与近视相关巩膜重塑有着千丝万缕的联系。我们认为这三条通路对于日后分析及研究巩膜重塑机制及巩膜重塑的干预手段具有价值。随着大数据时代的到来，数字化分析及信息共享为科研工作者提供了极大的便利，通过将大数据与LIM及FDM模型相结合的方式，未来对于巩膜重塑的研究将会有更广阔的空间。
