白细胞介素-23受体过表达对实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠辅助性T细胞17/调节性T细胞平衡的影响_《中华眼底病杂志》

作者：

吴怡媛 , 陈思思 , 杨超 , 魏瑞华 ,  粘红

天津医科大学眼科医院、眼视光学院、眼科研究所国家眼耳鼻喉疾病临床医学研究中心天津市分中心天津市视网膜功能与疾病重点实验室, 天津 300384;

关键词：

Th17细胞 T淋巴细胞，调节性实验性自身免疫性葡萄膜炎白细胞介素-23受体

DOI：

10.3760/cma.j.cn511434-20210809-00428

视频：

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目的初步探讨白细胞介素（IL）-23受体（IL-23R）过表达对实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）模型小鼠辅助性T细胞17（Th17细胞）/调节性T细胞（Treg细胞）平衡的影响。方法 8周龄雌性C57BL/6J小鼠12只，随机分为LV-Ctrl组、LV-IL-23R组，每组各6只。两组小鼠经尾静脉分别注射 LV-Ctrl、LV-IL-23R慢病毒；注射后7 d采用光感受器间维生素A类结合蛋白_1-20主动免疫构建EAU小鼠模型。免疫后13 d开始，每2天使用间接检眼镜观察小鼠眼底并进行临床评分。免疫后30 d，苏木精-伊红染色观察小鼠视网膜组织病理学改变。酶联免疫吸附测定检测两组小鼠血清中IL-17水平；流式细胞仪检测Th17细胞和Treg细胞比例；实时荧光定量聚合酶链反应检测IL-23R、IL-17、维甲酸相关孤儿受体γt（RORγt）、IL-10和叉头状转录因子p3（Foxp3） mRNA相对表达量。组间比较采用重复测量方差分析、独立样本Mann-Whitney U检验和独立样本t检验。结果与LV-Ctrl组比较，LV-IL-23R组小鼠视网膜炎症反应更重。免疫后13 d，LV-IL-23R组、LV-Ctrl组小鼠眼底炎症评分差异无统计学意义（t=－2.001，P=0.058）；免疫后15～29 d，LV-IL-23R组小鼠眼底炎症评分均高于LV-Ctrl组，差异有统计学意义（t=－4.429、－6.578、－7.768、－10.183、－6.325、－7.304、－4.841、－6.872，P＜0.001）。组织病理学检查显示，与LV-Ctrl组比较，LV-IL-23R组眼底炎性细胞浸润增多，视网膜结构破坏更为严重，组织病理学评分显著升高，差异有统计学意义（t=－4.339，P=0.001）。与LV-Ctrl组比较、LV-IL-23R组小鼠脾脏中IL-23R mRNA相对表达量显著升高，差异有统计学意义（Z=2.087，P=0.037）；T细胞中IL-17、RORγt mRNA相对表达量增加，IL-10、Foxp3 mRNA相对表达量降低，差异均有统计学意义（t=－6.313、－5.922、4.844、7.572，P=0.003、0.004、0.008、0.002）。与LV-Ctrl组比较、LV-IL-23R组小鼠血清中IL-17水平明显升高，差异有统计学意义（t=－5.423，P=0.002）；脾脏和淋巴结中Th17细胞比例明显升高，Treg细胞比例显著降低，差异有统计学意义（t=－4.290、3.700，P=0.002、0.006）。结论 IL-23R过表达可促使EAU小鼠的Th17/Treg失衡，加重EAU临床及病理表现。

引用本文： 吴怡媛, 陈思思, 杨超, 魏瑞华, 粘红. 白细胞介素-23受体过表达对实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠辅助性T细胞17/调节性T细胞平衡的影响. 中华眼底病杂志, 2022, 38(5): 389-395. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210809-00428 复制

自身免疫性葡萄膜炎是一种常见的致盲性眼病，其病因及发病机制尚不完全明确^[1]。CD4⁺T细胞在自身免疫性葡萄膜炎中发挥主导作用，其中，辅助性T细胞17（Th17）通过分泌白细胞介素（IL）-17等多种炎性因子，调节固有免疫和适应性免疫反应，是自身免疫性葡萄膜炎的主要致病细胞群^[2-4]；而调节性T细胞（Treg）特异性表达叉头状转录因子p3（Foxp3），主要分泌IL-10等抑炎因子，抑制机体对自身抗原的免疫反应^[5-6]。研究证实，Th17细胞与Treg细胞的平衡是维持眼内免疫稳态的基础，该平衡决定了自身免疫性葡萄膜炎的发展和转归^[7-8]。目前研究认为，IL-23是维持Th17细胞稳定性和致病性的关键细胞因子^[9-10]，IL-23与Th17细胞表面的IL-23受体（IL-23R）结合，促进Th17细胞分泌IL-17、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等炎性因子^[4]。研究发现，IL-23R/IL-17轴在自身免疫性关节炎、炎性肠病等多种自身免疫性疾病中发挥致病作用^[11-12]；在Vogt-Koyanagi-Harada综合征患者的外周血单个核细胞中，IL-23R的表达水平显著升高^[13]，提示IL-23R可能参与了自身免疫性葡萄膜炎的发生和发展。但IL-23R对自身免疫性葡萄膜炎的具体作用及机制尚不明确。因此，本研究以实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）为研究对象^[14]，采用慢病毒介导IL-23R过表达，初步探讨IL-23R对EAU疾病进程的影响和对Th17/Treg平衡的调控作用。现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料

人胚胎肾细胞系293T（美国ATCC细胞库）；IL-23R过表达质粒pReceiver-Lv201-IL-23R及其对照质粒（美国Gene-Copoeia公司）；辅助包装质粒pSPAX2和pMD2.G（美国Addgene公司）；LipoFiter^TM （上海汉恒生物有限公司）；聚乙二醇8000、Dulbecco改良Eagle培养基（美国Gibco公司）；光感受器间维生素A类结合蛋白_1-20（IRBP_1-20）多肽片段（上海生物工程股份有限公司合成）；结核分枝杆菌H37RA（美国Difco公司）；百日咳毒素、弗氏不完全佐剂（美国Sigma公司）；RPMI1640培养基、胎牛血清（美国Hyclone公司）；小鼠IL-17酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒、重组鼠IL-23蛋白（美国R&D公司）；RNA提取试剂盒（美国EZBioscience公司）；逆转录试剂盒、SYBR Green 2× Master Mix（美国Thermo公司）；佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）、布雷菲尔得菌素A（BFA）、钙离子霉素（美国Sigma公司）；固定剂、破膜剂、TruStain FcX™ PLUS封闭剂、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗小鼠IL-17流式抗体（FITC-IL-17）、巯基化藻红蛋白（PE）标记的抗小鼠CD4流式抗体（PE-CD4），FITC标记的抗小鼠CD4流式抗体（FITC-CD4）、PE标记的抗小鼠Foxp3流式抗体（PE-Foxp3）（美国Biolegend公司）；7900HTFAST实时聚合酶链反应（PCR）仪（爱普拜斯应用生物系统贸易上海有限公司）；FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 实验动物分组、EAU模型建立及T细胞分离

健康雌性C57BL/6J小鼠12只，鼠龄8～10周，体重约20 g，无特定病原体级（北京维通利华实验动物技术有限公司）。实验前排除眼部疾病及其他异常。饲养环境及实验操作符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》规定，并获得天津医科大学动物管理及使用委员会批准（批准号：TJYY2019110117）。

采用随机数字表法将小鼠分为LV-Ctrl组、LV-IL-23R组，每组各为6只。小鼠尾静脉分别注射200 μl滴度为1×10⁸ TU/ml的对照慢病毒或IL-23R过表达慢病毒^[15-16]。注射后7 d，两组小鼠腹腔注射800 ng百日咳毒素，于小鼠单后足和脊柱两侧皮下注射含有200 μg IRBP_1-20、0.8 mg结核分枝杆菌H37RA和不完全弗氏佐剂的乳化剂，建立EAU模型，免疫当天记作0 d。免疫后30 d，取小鼠脾脏和淋巴结研磨并过滤，将滤液加入尼龙柱密封，37 ℃培养1 h，完全培养基冲洗尼龙柱，得到T细胞悬液。

1.3 小鼠视网膜炎症临床观察及组织病理学检查

免疫后13 d开始，每2天行间接检眼镜检查，参照Caspi^[17]评分标准对炎症反应程度进行评分。免疫后30 d，深度麻醉处死小鼠，摘除眼球作石蜡病理切片，沿视盘矢状面制作5 μm厚度切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察视网膜病变情况。参照Caspi^[17]评分标准进行组织病理学评分。

1.4 实时定量PCR（qRT-PCR）检测小鼠脾脏中IL-23R及T细胞中IL-17、维甲酸相关孤儿受体γt（RORγt）、IL-10和Foxp3 mRNA相对表达量

分离各组小鼠脾脏后剪取部分脾脏组织研磨，提取脾脏总RNA；提取各组小鼠T细胞总RNA；将RNA逆转录合成cDNA，以磷酸甘油醛脱氢酶为内参照。采用Premier 5.0软件设计正向、反向引物（表1）。反应体系：SYBR Green 2× Master Mix 4 μl，正反向引物各1 μl，cDNA模板2 μl；反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火及延伸1 min，40个循环。相对表达式计算使用相对量化方程2^−ΔΔCt。

表1 引物序列

表选项

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检测因子	正向引物（5’→3’）	反向引物（5’→3’）
IL-23R	CAGAGGACATCCTGCTTCAGGTA	GATGGCCAAGAAGACCATTCC
IL-17	CCTGGCGGCTACAGTGAAG	TTTGGACACGCTGAGCTTTG
RORγt	CCTCAGCGCCCTGTGTTTT	GCATGCAGCTTTTGCCTGTT
IL-10	GATGCCCCAGGCAGAGAA	CACCCAGGGAATTCAAATGC
Foxp3	CATTGGTTTACTCGCATGTTCG	TGTGGCGGATGGCATTCTT
GAPDH	CATGGCCTTCCGTGTTCCTA	GCGGCACGTCAGATCCA
注：IL：白细胞介素；ROR：维甲酸相关孤儿受体；Foxp3：叉头状转录因子p3；GAPDH：磷酸甘油醛脱氢酶

1.5 ELISA法检测小鼠血清中IL-17水平

免疫后30 d，摘除各组小鼠眼球，收集静脉血，离心后吸取上层血清。参照小鼠IL-17 ELISA试剂盒说明书操作，检测各组小鼠血清中IL-17水平。

1.6 流式细胞仪检测Th17、Treg细胞比率

Treg细胞检测：T细胞中加入破膜固定液，4 ℃避光过夜；TruStainFcX™ PLUS封闭细胞表面Fc受体，加入FITC-CD4和PE-Foxp3抗体，4 ℃避光孵育2 h染色。Th17细胞检测：T细胞与经射线处理的抗原提呈细胞共培养，加入10 mg/ml IRBP_1-20和10 ng/ml IL-23刺激，8 d后收集共培养细胞，于含有50 ng/ml PMA、1 μg/ml BFA和1 μg/ml钙离子霉素的培养基中刺激4～6 h，破膜固定，封闭，FITC-IL-17和PE-CD4抗体标记。

1.7 统计学方法

采用SPSS26.0软件行统计学分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，偏态分布的计量资料以M（IQR）表示。采用Shapiro-Wilk检验数据正态性，组间均数以Levene检验方差齐性。组间差异比较采用独立样本t检验、独立样本Mann-Whitney U检验或重复测量方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

qRT-PCR结果显示，LV-Ctrl组、LV-IL-23R组小鼠脾脏中IL-23R mRNA相对表达量分别为1.00（1.00）、9.87（2.79）；LV-IL-23R组小鼠IL-23R mRNA相对表达量显著升高，差异有统计学意义（Z=2.087，P=0.037）。

LV-Ctrl组，免疫后13～15 d，视网膜血管轻微炎症和视盘水肿；17～21 d，疾病逐渐加重，血管扩张，周围可见白色渗出，视网膜弥漫性点状浸润，21 d炎症达到高峰；22～29 d，炎症逐渐缓解至基本消退。LV-IL-23R组，视网膜血管纡曲、扩张伴血管鞘，视网膜大面积水肿，点状浸润增多并形成大量线状炎性浸润灶。免疫后13 d，LV-IL-23R组、LV-Ctrl组小鼠眼底炎症评分差异无统计学意义（t=－2.001，P=0.058）；免疫后15～29 d，LV-IL-23R组小鼠眼底炎症评分均高于LV-Ctrl组，差异有统计学意义（t=－4.429、－6.578、－7.768、－10.183、－6.325、－7.304、－4.841、－6.872，P＜0.001）（图1）。

图1 LV-Ctrl组、LV-IL-23R组（n=6）小鼠免疫后不同时间点眼底炎症临床评分比较。与LV-Ctrl组比较，^**P＜0.01。IL-23R：白细胞介素-23受体

图选项

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