准确的玻璃体、视网膜相关组织标本取材及保存方法是保证临床诊断及开展严谨基础研究的基础。玻璃体标本取材的临床用途包括微生物培养、细胞学检测、变性性疾病检测、PCR分析、液基细胞学检测细胞形态等；实验研究用途包括DNA基因分析、蛋白定量分析、代谢物检查、RNA含量定量分析、细胞因子测定等。视网膜标本取材主要用于视网膜增生膜的PCR分析、免疫组织化学染色、免疫荧光检查、微血管密度评价以及细胞分离和培养等。了解玻璃体视网膜手术标本的取材和相关检测技术、材料的应用，可为玻璃体视网膜疾病的诊断提供更全面的思路及相关基础研究提供更广泛的参考。
引用本文： 陈琼, 程朝晖, 胡博杰. 玻璃体和视网膜相关组织标本取材及应用研究现状. 中华眼底病杂志, 2020, 36(5): 396-399. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20190312-00091 复制
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玻璃体、视网膜是眼球内重要结构，一旦发生病变将对人眼成像过程产生严重影响，甚至可能导致视力严重损害。玻璃体视网膜疾病病因复杂，诊治方法多样，玻璃体、视网膜手术学在医疗技术不断进步及疾病诊治率不断提高的现状下也进展迅速。对玻璃体视网膜手术取材的进一步研究，有助于细化临床及基础研究者对相关疾病的认识，也希望在进一步对玻璃体、视网膜疾病认识的基础上，能对玻璃体、视网膜疾病的预防、诊治、预后有所帮助。现就玻璃体、视网膜取材的相关研究作一综述。
1 玻璃体
玻璃体是透明的胶体结构，其结构由胶原细纤维及充填其间的大分子透明质酸组成；胶原细纤维构成玻璃体的支架，使玻璃体具有一定的韧性和可塑性，是眼内屈光间质的重要组成部分[1]。玻璃体成分的获取途径主要有：（1）细针从平坦部进针连接注射器抽取所需玻璃体[2]。生理状态下玻璃体为胶体结构，不易被注射器吸取，所以该方法适用于相对液化的玻璃体。（2）因玻璃体视网膜疾病行玻璃体切割手术时，在灌注开通之前切取未稀释的玻璃体[3-4]。该方法获取玻璃体时，注意一定是在灌注开通之前收集玻璃体于干燥容器中[5]。（3）因诊断眼内疾病需要，行诊断性玻璃体切割手术[6]。诊断性玻璃体切割时的取材部位首选中央部玻璃体，但在玻璃体病变不均匀时，为提高诊断的灵敏度或实验取材的准确性可以选取病变部位的玻璃体。（4）尸体解剖时用注射器连接细针头抽取玻璃体[7]。（5）眼球穿通伤时，于清创缝合之前取材相对未被污染的玻璃体成份[8]。以上方法取材玻璃体时均遵循外科手术的无菌原则，取材所得玻璃体可存于液氮罐中或低温储存待用[9]。有研究者提出玻璃体抽吸后，玻璃体腔注入适量广谱抗生素作为取材手术后的初步处理方式[2]。放弃玻璃体取材的情况为任何原因导致的存在玻璃体积血的样本[10]。
1.1 玻璃体取材的临床用途
1.1.1 微生物培养
玻璃体分出一部分用于细菌及真菌培养。玻璃体迅速进行革兰染色，经氢氧化钾湿化涂片，接种于培养基上于相应鉴定目的条件下培养，每日检查培养基，弃去直到观察截止日期无菌落生长迹象的培养基。培养出的独立菌落经API试纸进行鉴定[11]。有研究者提出玻璃体切割刀大小会影响玻璃体微生物学培养结果，较小地玻璃体切割刀（30G）获取的标本培养阳性率为80%，而更大地玻璃体切割刀（25G/27G）获取的标本培养阳性率仅为31%，且差异有统计学意义[2]。其具体原因有待更多研究者探索验证。玻璃体的微生物学培养在临床上主要用于感染性眼内炎的诊断及指导选择敏感性抗生素[12]。
1.1.2 切片制备
获取的玻璃体离心弃去上层清液，10%中性福尔马林固定过夜，常规石蜡包埋切片。显微镜下记录细胞数量、背景外观、细胞类型和细胞异型性及坏死范围。该石蜡切片细胞学检测可用于眼内淋巴瘤等眼内恶性疾病的诊断和鉴别诊断[13]。
1.1.3 变性检测
玻璃体标本恢复至室温，刚果红染色。显示粗纤维聚集，偏振光下呈苹果绿色至橙色二色双折射，与淀粉样变性一致。提示玻璃体淀粉样变性。玻璃体淀粉样变性可提示系统性疾病，有助于发现部分全身性疾病及家族性疾病，玻璃体变性检测在无全身表现的非家族性原发性玻璃体淀粉样变性等难以确诊的疾病方面具有不可替代的优势[14]。
1.1.4 PCR分析
DNA提取工具盒提取玻璃体标本中DNA，低温储存。应用针对16S rRNA基因具有特异性的细菌通用引物，进行PCR扩增[11]。将扩增混合液加入PCR反应体系，经变性、退火、延伸反应；第二轮PCR取第一轮扩增产物2 μl为模板，嵌套式正向和反向引物进行反应。扩增的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色后显像[11]。也有研究者从玻璃体中进行基因组DNA模板提取，经洗脱，构建PCR反应体系，从DNA扩增16S rDNA，按一般过程完成PCR过程，其产物经电泳分离并染色显像[15]。玻璃体PCR技术可以更准确地确定病原菌，对疑似眼内炎患者进行抗生素治疗时，可提供指导作用。但由于样本量小、细菌负荷低、既往使用过抗生素以及微生物的挑剔特性等特点也使得这一方法的阳性率较低，未来的研究和实践中需要更多的研究者攻坚克难。
1.1.5 液基细胞学检查
玻璃体标品经液基细胞保存液保存，玻璃体与保存液于试管中按1:3混合至总容积1.2 ml，室温孵育12 h，涂片并于95%酒精或10%福尔马林缓冲液中处理10 min，伊红染色后细胞免疫化学染色检查[4]。玻璃体液基细胞学是细胞学诊断方法，可直接检测细胞种类及数量从而做出诊断，液基细胞学检查不仅可以直接观察到变性的细胞，还可以结合细胞标记的方法识别更多的细胞及微生物等，液基细胞学诊断的准确性，还可通过相应细胞因子和趋化因子提高[4]。
1.2 玻璃体取材的基础研究用途
1.2.1 DNA基因分析
有机提取尸体眼玻璃体DNA，利用PicoGreen dsDNA定量试剂和Fluoroskan Ascent FL对DNA进行荧光定量分析。该研究者是从法院尸检途径获取玻璃体中的DNA，获取的DNA可用于基础实验的进一步研究[16]。
1.2.2 蛋白定量分析
离心处理去除上层清液的玻璃体低温储存，按照ELISA原理对样本进行加样、复温、孵化、反应、水洗、终止反应，吸光度[A，旧称光密度（OD）]值测定进行蛋白定量[3]。也有研究在测定玻璃体血红蛋白浓度时用分光光度计（经典Harboe法）测定玻璃体中微摩尔浓度级的血红蛋白含量[17]。玻璃体蛋白含量表达检测可用于研究相关疾病病理机制和病程进展中的生物标记，为诊断及治疗疾病提供更多的思路。
也有研究对尸体眼取材的玻璃体制备石蜡切片[18]。玻璃体腔注入10%甲醛溶液0.5 ml，其后置于10%甲醛溶液中24 h，以保持眼球的完整。石蜡包埋5 μm厚地样本制备切片用于免疫荧光染色和荧光原位杂交。该方法利用抗原抗体的特异性反应用于检测靶蛋白[18]。
1.2.3 代谢物检查
每个标本分别采用水和氯仿进行萃取。将混合液涡旋、平衡、层析、分析[9]。玻璃体代谢物分析，旨在阐明不同代谢产物和代谢途径与疾病的发生发展关系，从而为疾病的研究提供更多可能性参考。
尸体眼玻璃体钾含量测定。玻璃体标本离心，为避免堵塞分析仪器的细管，取上层清液进行分析。尸体眼钾离子随时间浓度改变监测可在实践中指导死亡执行方式的选择[19]。尸体眼玻璃体重金属定量，玻璃体组织先称得湿重，然后于95 ℃环境中过夜晾干，隔日称取干重，经组织溶解、加水、涡旋、质谱仪同步分析、稀释，再将以上样品经涡旋吸入气动雾化器，产生的气溶胶被导向热等离子体用氩气流放电。仪器表反应定义为分析物浓度和离子计数（分析物离子计数/内部标准离子计数）之间的线性关系，通过读取底物的离子计数比率得到分析物浓度。以消化管液的浓度计算金属组织的干湿重量[20]。
因玻璃体正常位于封闭的眼球内，尸体眼玻璃体改变受环境影响较小，其代谢物的分析在法医鉴定中能够提供较为准确的信息[21]。
1.2.4 RNA表达
玻璃体标本置于含无菌DNA酶的无核糖核酸酶冷冻管，低温保存。离心，去除细胞碎片，将上层清液收集于另一支新地无菌离心管中，再次离心，取上清液低温储存备用于RNA量化或细胞因子测量。依实验条件选用合适地RNA提取包进行纯化。分光光度计评估RNA浓度和纯度，纯化的RNA低温保存，待做进一步分析[22]。从相关RNA含量定性分析疾病，探测疾病引起的细胞分子水平变化，从而为疾病的诊治探索新思路。
1.2.5 细胞因子测定
利用抗原抗体反应原理，应用测量相应底物所需的仪器和设备对玻璃体标本中的细胞因子进行定量分析[7, 23]，如应用ELISA进行细胞因子定量测定[22]。细胞因子的变化往往是疾病分子水平改变的表现，明确疾病分子水平的改变能为疾病的诊治探明靶点。
2 视网膜及其前膜
视网膜是位于眼球壁内层透明的膜状物，内为玻璃体腔，外侧紧贴脉络膜，前始于锯齿缘，后止于视盘，是视觉形成的初始部位[24]。视网膜组织及其前膜（增生膜）的获取途径主要为玻璃体切割手术中，显微镜下分离纤维血管增生膜，眼内镊夹住，切口处取出[23]，立即置于无钙、无镁平衡盐溶液（BSS）的标本杯中。二级无菌生物安全条件下将膜分为小片，用于免疫组织化学检查或细胞培养[25]。
2.1 视网膜增生膜
2.1.1 PCR分析
应用Trizol试剂从冷冻标本中提取和纯化总RNA，按试剂盒要求进行逆转录合成DNA，PCR扩增DNA[26]。DNA在生物学行为中被转录为RNA，RNA指导蛋白质的合成。蛋白质在疾病的发生发展中具有重要作用，测定靶蛋白的DNA含量，对深化疾病的认识过程可提供重要信息。
2.1.2 免疫组织化学分析
利用免疫学中的抗原抗体反应，借助可见标记物，对相应抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法。常用地免疫组织化学方法有荧光免疫和酶免疫组织化学技术、金标免疫组织化学技术和免疫电镜技术[27]。
增生性玻璃体视网膜病变（PVR）增生膜于室温下在含10%福尔马林的Dulbecco缓冲液中固定24 h，然后存于4 ℃的缓冲液中待用于石蜡包埋。石蜡包埋后将其切成6 mm厚的连续切片，二甲苯脱蜡，于不同浓度的酒精中再水化，PBS液洗涤。切片应用相应抗体进行免疫组织化学检查[25]。
也有研究者将剥离的视网膜前膜置于含4%多聚甲醛的试管中固定，然后嵌入最佳切割温度化合物中进行免疫组织化学和免疫荧光检查。复合物切片经室温风干、溶解、清洗，切片用正常驴血清孵育30 min以阻断非特异染色，然后与相应抗体反应，以检测待测因子的量[26]。
2.1.3 免疫荧光检查
对冷冻切片进行封闭，然后与相应单克隆抗体反应，荧光显微镜下观察阳性反应的玻片[26]。另有文献报道，切片脱蜡、脱水、冲洗后，微波法提取抗原作为预处理，牛血清白蛋白孵育30 min，最后与相应抗体进行孵育反应[28]。此外，有研究者将来自增生膜的细胞接种到细胞板上保存24～72 h，细胞经固定、洗涤、渗透、封闭处理。为识别具体细胞类型，增生膜细胞与异硫氰酸荧光素酯共轭的单克隆抗体一同孵育，分别与一抗、二抗进行孵育反应，PBS洗涤3次，盖片，显微镜下记录图像[25]。采用基础实验原理对标本所含靶蛋白进行测定，于蛋白质水平探讨疾病发生发展的特点，从而寻找靶向治疗和诊断学方法，将继续成为今后研究的一大热点。
2.1.4 微血管密度评价
选取合适地视野计数，高倍显微镜下（×400）可直接计数增生型糖尿病视网膜病变（PDR）增生膜中CD31阳性的微血管数量[28]。特异性微血管密度的改变及与之相关其他细胞因子的改变，在特定疾病中的变化趋势，往往提示疾病发生发展而产生的分子水平的改变。
2.1.5 细胞分离和培养
将PVR的增生膜转移至含胶原酶Ⅱ及0.25%牛血清的PBS中，经孵育、吹打、再悬浮，最终将膜消化成单个细胞悬液。再将膜在Dulbecco改良的Eagle培养基中重新悬浮，并接种于48孔板上[25]。从PDR的视网膜前膜获取的细胞，可用于细胞水平基础研究。目前这一来源的细胞在基础研究中多用作靶细胞。
2.2 黄斑前膜
有研究者在行23G玻璃体切割手术及玻璃体后脱离完成后，眼内镊辅助下剥膜，亮蓝染色，手术完毕时玻璃体腔填充BSS。获取的黄斑前膜及内界膜（ILM）置于BSS中，细胞培养室进一步处理后，标本于显微镜下铺平固定，行细胞培养及相应处理，最后行细胞免疫组织化学检测[29]。研究黄斑前膜及ILM的细胞学行为，可为进一步探索玻璃体视网膜界面的病理表现以及抗纤维化治疗提供参考[29]。
2.3 ILM
23G玻璃体切割手术完成玻璃体后脱离，关闭灌注、染色、冲洗、剥除ILM；超薄切片机将其切成5 mm厚切片，亚甲蓝染色，光学显微镜观察。也有研究者将ILM固定于含戊二醛的PBS中，固定、切片、染色，光学显微镜拍照。对于ILM的研究，揭示了ILM与黄斑前膜的组织成分关系。今后需大量研究阐明这些问题细胞和视网膜神经元之间的变化关系[30]。
2.4 视网膜
临床及基础研究对于视网膜的取材较少，最常见地取材及操作为视网膜获取及视网膜细胞的制备与储存，并将其用于基础研究。由于该部分内容缺乏相应的参考文献，在此不做详细讨论。
玻璃体视网膜手术标本取材及保存方法为正确的临床诊断及严谨的基础研究奠定基础。经查阅中英文重要数据库，对于玻璃体视网膜手术取材及保存方法鲜有综述。本文希望能够为玻璃体视网膜疾病的诊断提供更全面的思路及相关基础研究提供更广泛的参考。目前，玻璃体视网膜取材及保存弊端也较明显，如通常单例取材所得组织较少、多数取材需在手术条件下或手术过程中获取等。限制相关检测技术发展的弊端，需要更多的研究来探索并克服。
玻璃体、视网膜是眼球内重要结构，一旦发生病变将对人眼成像过程产生严重影响，甚至可能导致视力严重损害。玻璃体视网膜疾病病因复杂，诊治方法多样，玻璃体、视网膜手术学在医疗技术不断进步及疾病诊治率不断提高的现状下也进展迅速。对玻璃体视网膜手术取材的进一步研究，有助于细化临床及基础研究者对相关疾病的认识，也希望在进一步对玻璃体、视网膜疾病认识的基础上，能对玻璃体、视网膜疾病的预防、诊治、预后有所帮助。现就玻璃体、视网膜取材的相关研究作一综述。
1 玻璃体
玻璃体是透明的胶体结构，其结构由胶原细纤维及充填其间的大分子透明质酸组成；胶原细纤维构成玻璃体的支架，使玻璃体具有一定的韧性和可塑性，是眼内屈光间质的重要组成部分[1]。玻璃体成分的获取途径主要有：（1）细针从平坦部进针连接注射器抽取所需玻璃体[2]。生理状态下玻璃体为胶体结构，不易被注射器吸取，所以该方法适用于相对液化的玻璃体。（2）因玻璃体视网膜疾病行玻璃体切割手术时，在灌注开通之前切取未稀释的玻璃体[3-4]。该方法获取玻璃体时，注意一定是在灌注开通之前收集玻璃体于干燥容器中[5]。（3）因诊断眼内疾病需要，行诊断性玻璃体切割手术[6]。诊断性玻璃体切割时的取材部位首选中央部玻璃体，但在玻璃体病变不均匀时，为提高诊断的灵敏度或实验取材的准确性可以选取病变部位的玻璃体。（4）尸体解剖时用注射器连接细针头抽取玻璃体[7]。（5）眼球穿通伤时，于清创缝合之前取材相对未被污染的玻璃体成份[8]。以上方法取材玻璃体时均遵循外科手术的无菌原则，取材所得玻璃体可存于液氮罐中或低温储存待用[9]。有研究者提出玻璃体抽吸后，玻璃体腔注入适量广谱抗生素作为取材手术后的初步处理方式[2]。放弃玻璃体取材的情况为任何原因导致的存在玻璃体积血的样本[10]。
1.1 玻璃体取材的临床用途
1.1.1 微生物培养
玻璃体分出一部分用于细菌及真菌培养。玻璃体迅速进行革兰染色，经氢氧化钾湿化涂片，接种于培养基上于相应鉴定目的条件下培养，每日检查培养基，弃去直到观察截止日期无菌落生长迹象的培养基。培养出的独立菌落经API试纸进行鉴定[11]。有研究者提出玻璃体切割刀大小会影响玻璃体微生物学培养结果，较小地玻璃体切割刀（30G）获取的标本培养阳性率为80%，而更大地玻璃体切割刀（25G/27G）获取的标本培养阳性率仅为31%，且差异有统计学意义[2]。其具体原因有待更多研究者探索验证。玻璃体的微生物学培养在临床上主要用于感染性眼内炎的诊断及指导选择敏感性抗生素[12]。
1.1.2 切片制备
获取的玻璃体离心弃去上层清液，10%中性福尔马林固定过夜，常规石蜡包埋切片。显微镜下记录细胞数量、背景外观、细胞类型和细胞异型性及坏死范围。该石蜡切片细胞学检测可用于眼内淋巴瘤等眼内恶性疾病的诊断和鉴别诊断[13]。
1.1.3 变性检测
玻璃体标本恢复至室温，刚果红染色。显示粗纤维聚集，偏振光下呈苹果绿色至橙色二色双折射，与淀粉样变性一致。提示玻璃体淀粉样变性。玻璃体淀粉样变性可提示系统性疾病，有助于发现部分全身性疾病及家族性疾病，玻璃体变性检测在无全身表现的非家族性原发性玻璃体淀粉样变性等难以确诊的疾病方面具有不可替代的优势[14]。
1.1.4 PCR分析
DNA提取工具盒提取玻璃体标本中DNA，低温储存。应用针对16S rRNA基因具有特异性的细菌通用引物，进行PCR扩增[11]。将扩增混合液加入PCR反应体系，经变性、退火、延伸反应；第二轮PCR取第一轮扩增产物2 μl为模板，嵌套式正向和反向引物进行反应。扩增的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色后显像[11]。也有研究者从玻璃体中进行基因组DNA模板提取，经洗脱，构建PCR反应体系，从DNA扩增16S rDNA，按一般过程完成PCR过程，其产物经电泳分离并染色显像[15]。玻璃体PCR技术可以更准确地确定病原菌，对疑似眼内炎患者进行抗生素治疗时，可提供指导作用。但由于样本量小、细菌负荷低、既往使用过抗生素以及微生物的挑剔特性等特点也使得这一方法的阳性率较低，未来的研究和实践中需要更多的研究者攻坚克难。
1.1.5 液基细胞学检查
玻璃体标品经液基细胞保存液保存，玻璃体与保存液于试管中按1:3混合至总容积1.2 ml，室温孵育12 h，涂片并于95%酒精或10%福尔马林缓冲液中处理10 min，伊红染色后细胞免疫化学染色检查[4]。玻璃体液基细胞学是细胞学诊断方法，可直接检测细胞种类及数量从而做出诊断，液基细胞学检查不仅可以直接观察到变性的细胞，还可以结合细胞标记的方法识别更多的细胞及微生物等，液基细胞学诊断的准确性，还可通过相应细胞因子和趋化因子提高[4]。
1.2 玻璃体取材的基础研究用途
1.2.1 DNA基因分析
有机提取尸体眼玻璃体DNA，利用PicoGreen dsDNA定量试剂和Fluoroskan Ascent FL对DNA进行荧光定量分析。该研究者是从法院尸检途径获取玻璃体中的DNA，获取的DNA可用于基础实验的进一步研究[16]。
1.2.2 蛋白定量分析
离心处理去除上层清液的玻璃体低温储存，按照ELISA原理对样本进行加样、复温、孵化、反应、水洗、终止反应，吸光度[A，旧称光密度（OD）]值测定进行蛋白定量[3]。也有研究在测定玻璃体血红蛋白浓度时用分光光度计（经典Harboe法）测定玻璃体中微摩尔浓度级的血红蛋白含量[17]。玻璃体蛋白含量表达检测可用于研究相关疾病病理机制和病程进展中的生物标记，为诊断及治疗疾病提供更多的思路。
也有研究对尸体眼取材的玻璃体制备石蜡切片[18]。玻璃体腔注入10%甲醛溶液0.5 ml，其后置于10%甲醛溶液中24 h，以保持眼球的完整。石蜡包埋5 μm厚地样本制备切片用于免疫荧光染色和荧光原位杂交。该方法利用抗原抗体的特异性反应用于检测靶蛋白[18]。
1.2.3 代谢物检查
每个标本分别采用水和氯仿进行萃取。将混合液涡旋、平衡、层析、分析[9]。玻璃体代谢物分析，旨在阐明不同代谢产物和代谢途径与疾病的发生发展关系，从而为疾病的研究提供更多可能性参考。
尸体眼玻璃体钾含量测定。玻璃体标本离心，为避免堵塞分析仪器的细管，取上层清液进行分析。尸体眼钾离子随时间浓度改变监测可在实践中指导死亡执行方式的选择[19]。尸体眼玻璃体重金属定量，玻璃体组织先称得湿重，然后于95 ℃环境中过夜晾干，隔日称取干重，经组织溶解、加水、涡旋、质谱仪同步分析、稀释，再将以上样品经涡旋吸入气动雾化器，产生的气溶胶被导向热等离子体用氩气流放电。仪器表反应定义为分析物浓度和离子计数（分析物离子计数/内部标准离子计数）之间的线性关系，通过读取底物的离子计数比率得到分析物浓度。以消化管液的浓度计算金属组织的干湿重量[20]。
因玻璃体正常位于封闭的眼球内，尸体眼玻璃体改变受环境影响较小，其代谢物的分析在法医鉴定中能够提供较为准确的信息[21]。
1.2.4 RNA表达
玻璃体标本置于含无菌DNA酶的无核糖核酸酶冷冻管，低温保存。离心，去除细胞碎片，将上层清液收集于另一支新地无菌离心管中，再次离心，取上清液低温储存备用于RNA量化或细胞因子测量。依实验条件选用合适地RNA提取包进行纯化。分光光度计评估RNA浓度和纯度，纯化的RNA低温保存，待做进一步分析[22]。从相关RNA含量定性分析疾病，探测疾病引起的细胞分子水平变化，从而为疾病的诊治探索新思路。
1.2.5 细胞因子测定
利用抗原抗体反应原理，应用测量相应底物所需的仪器和设备对玻璃体标本中的细胞因子进行定量分析[7, 23]，如应用ELISA进行细胞因子定量测定[22]。细胞因子的变化往往是疾病分子水平改变的表现，明确疾病分子水平的改变能为疾病的诊治探明靶点。
2 视网膜及其前膜
视网膜是位于眼球壁内层透明的膜状物，内为玻璃体腔，外侧紧贴脉络膜，前始于锯齿缘，后止于视盘，是视觉形成的初始部位[24]。视网膜组织及其前膜（增生膜）的获取途径主要为玻璃体切割手术中，显微镜下分离纤维血管增生膜，眼内镊夹住，切口处取出[23]，立即置于无钙、无镁平衡盐溶液（BSS）的标本杯中。二级无菌生物安全条件下将膜分为小片，用于免疫组织化学检查或细胞培养[25]。
2.1 视网膜增生膜
2.1.1 PCR分析
应用Trizol试剂从冷冻标本中提取和纯化总RNA，按试剂盒要求进行逆转录合成DNA，PCR扩增DNA[26]。DNA在生物学行为中被转录为RNA，RNA指导蛋白质的合成。蛋白质在疾病的发生发展中具有重要作用，测定靶蛋白的DNA含量，对深化疾病的认识过程可提供重要信息。
2.1.2 免疫组织化学分析
利用免疫学中的抗原抗体反应，借助可见标记物，对相应抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法。常用地免疫组织化学方法有荧光免疫和酶免疫组织化学技术、金标免疫组织化学技术和免疫电镜技术[27]。
增生性玻璃体视网膜病变（PVR）增生膜于室温下在含10%福尔马林的Dulbecco缓冲液中固定24 h，然后存于4 ℃的缓冲液中待用于石蜡包埋。石蜡包埋后将其切成6 mm厚的连续切片，二甲苯脱蜡，于不同浓度的酒精中再水化，PBS液洗涤。切片应用相应抗体进行免疫组织化学检查[25]。
也有研究者将剥离的视网膜前膜置于含4%多聚甲醛的试管中固定，然后嵌入最佳切割温度化合物中进行免疫组织化学和免疫荧光检查。复合物切片经室温风干、溶解、清洗，切片用正常驴血清孵育30 min以阻断非特异染色，然后与相应抗体反应，以检测待测因子的量[26]。
2.1.3 免疫荧光检查
对冷冻切片进行封闭，然后与相应单克隆抗体反应，荧光显微镜下观察阳性反应的玻片[26]。另有文献报道，切片脱蜡、脱水、冲洗后，微波法提取抗原作为预处理，牛血清白蛋白孵育30 min，最后与相应抗体进行孵育反应[28]。此外，有研究者将来自增生膜的细胞接种到细胞板上保存24～72 h，细胞经固定、洗涤、渗透、封闭处理。为识别具体细胞类型，增生膜细胞与异硫氰酸荧光素酯共轭的单克隆抗体一同孵育，分别与一抗、二抗进行孵育反应，PBS洗涤3次，盖片，显微镜下记录图像[25]。采用基础实验原理对标本所含靶蛋白进行测定，于蛋白质水平探讨疾病发生发展的特点，从而寻找靶向治疗和诊断学方法，将继续成为今后研究的一大热点。
2.1.4 微血管密度评价
选取合适地视野计数，高倍显微镜下（×400）可直接计数增生型糖尿病视网膜病变（PDR）增生膜中CD31阳性的微血管数量[28]。特异性微血管密度的改变及与之相关其他细胞因子的改变，在特定疾病中的变化趋势，往往提示疾病发生发展而产生的分子水平的改变。
2.1.5 细胞分离和培养
将PVR的增生膜转移至含胶原酶Ⅱ及0.25%牛血清的PBS中，经孵育、吹打、再悬浮，最终将膜消化成单个细胞悬液。再将膜在Dulbecco改良的Eagle培养基中重新悬浮，并接种于48孔板上[25]。从PDR的视网膜前膜获取的细胞，可用于细胞水平基础研究。目前这一来源的细胞在基础研究中多用作靶细胞。
2.2 黄斑前膜
有研究者在行23G玻璃体切割手术及玻璃体后脱离完成后，眼内镊辅助下剥膜，亮蓝染色，手术完毕时玻璃体腔填充BSS。获取的黄斑前膜及内界膜（ILM）置于BSS中，细胞培养室进一步处理后，标本于显微镜下铺平固定，行细胞培养及相应处理，最后行细胞免疫组织化学检测[29]。研究黄斑前膜及ILM的细胞学行为，可为进一步探索玻璃体视网膜界面的病理表现以及抗纤维化治疗提供参考[29]。
2.3 ILM
23G玻璃体切割手术完成玻璃体后脱离，关闭灌注、染色、冲洗、剥除ILM；超薄切片机将其切成5 mm厚切片，亚甲蓝染色，光学显微镜观察。也有研究者将ILM固定于含戊二醛的PBS中，固定、切片、染色，光学显微镜拍照。对于ILM的研究，揭示了ILM与黄斑前膜的组织成分关系。今后需大量研究阐明这些问题细胞和视网膜神经元之间的变化关系[30]。
2.4 视网膜
临床及基础研究对于视网膜的取材较少，最常见地取材及操作为视网膜获取及视网膜细胞的制备与储存，并将其用于基础研究。由于该部分内容缺乏相应的参考文献，在此不做详细讨论。
玻璃体视网膜手术标本取材及保存方法为正确的临床诊断及严谨的基础研究奠定基础。经查阅中英文重要数据库，对于玻璃体视网膜手术取材及保存方法鲜有综述。本文希望能够为玻璃体视网膜疾病的诊断提供更全面的思路及相关基础研究提供更广泛的参考。目前，玻璃体视网膜取材及保存弊端也较明显，如通常单例取材所得组织较少、多数取材需在手术条件下或手术过程中获取等。限制相关检测技术发展的弊端，需要更多的研究来探索并克服。